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色譜分析的重要作用之一是對樣品進(jìn)行定量，色譜定量的依據(jù)是：組分的重量或濃度與檢測器的響應(yīng)信號成正比。選擇合適的定量方法時，除需要考慮相對定量還是絕對定量外，同時也需要考慮化合物的線性響應(yīng)范圍，是否有合適內(nèi)標(biāo)、是否有標(biāo)準(zhǔn)品等。今天我們來了解一下色譜是如何定量的。
在所有的色譜檢測器中，除了FPD之外，所有的檢測器都遵從線性響應(yīng)，也就是說m=KS。這里m指單位時間內(nèi)到達(dá)檢測器的待測物質(zhì)的量（包括質(zhì)量或物質(zhì)的量），K表示線性響應(yīng)系數(shù)，S表示檢測器響應(yīng)信號的值。也就是說，檢測器響應(yīng)信號的大小與單位時間到達(dá)檢測器的被測物質(zhì)的總量成正比。當(dāng)然我們也知道，這個關(guān)系是有范圍的，量太大或者太小，都會脫離線性。
2、其次就是第二條，塔板理論。塔板理論充分闡述了峰高與進(jìn)樣量之間的關(guān)系，或者說他們之間是成正比的。這個可以參考對塔板理論的說明。
根據(jù)這兩條，可以肯定的說待測物質(zhì)的峰高與待測物的進(jìn)樣總量成正比�；蛘呃梦⒎e分可以推斷出待測物質(zhì)的峰面積和待測物的進(jìn)樣總量成正比。既然峰高和峰面積都與進(jìn)樣總量成正比，為什么我們喜歡用峰面積，而不是更簡單的峰高呢？這個問題也很簡單，因?yàn)樗謇碚摬煌耆_，峰形經(jīng)常不完全滿足正態(tài)分布，所以峰高的代表性不足。什么時候峰高能夠有良好的代表性？很明顯，峰形良好而且對稱，成良好的正態(tài)分布曲線形狀的時候，或者說峰形尖銳且對稱的時候。色譜峰經(jīng)常拖尾，所以用峰面積定量就可以了，峰面積絕大多數(shù)情形下都具有很好的代表性。但是在檢測器超載，或模數(shù)轉(zhuǎn)換器超載，或峰面積積分不準(zhǔn)，或進(jìn)樣代表性不足，以及一些其他特殊情形下，用峰面積也不能得到正確結(jié)果。但無論如何，用峰面積定量已經(jīng)是我們可實(shí)行的最準(zhǔn)確方法了。
由于不同的化合物在同一個檢測器的響應(yīng)因子不同，甚至同一個化合物不同濃度在同一檢測器的響應(yīng)因子不同，簡單地說就是化合物在檢測器的響應(yīng)不呈線性，或者線性范圍比較窄。選擇合適的定量方法時，除需要考慮是相對定量還是絕對定量外，同時需要考察化合物的線性響應(yīng)范圍、是否有合適內(nèi)標(biāo)、是否有標(biāo)準(zhǔn)品等。接下來就主要介紹下色譜分析中常用的三種定量方法：面積歸一化法、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。
外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣，測得峰面積的平均值，用下式計(jì)算樣品中i組分的量：
準(zhǔn)確稱量W克樣品，再準(zhǔn)確稱量Ws克內(nèi)標(biāo)物，加入至樣品中，混勻，進(jìn)樣。測量待測組分i的峰面積Ai及內(nèi)標(biāo)物的峰面積As，則i組分在W克樣品中所含的重量Wi，與內(nèi)標(biāo)物的重量Wi，有下述關(guān)系：
優(yōu)點(diǎn)：①在進(jìn)樣量不超限(色譜柱不超載)的范圍內(nèi)，定量結(jié)果與進(jìn)樣量的重復(fù)性無關(guān)。②只要被測組分及內(nèi)標(biāo)物出峰，且分離度合乎要求，就可定量，與其他組分是否出峰無關(guān)。③很適用于測定藥物中微量有效成分或雜質(zhì)的含量。由于雜質(zhì)(或微量組分)與主要成分含量相差懸殊，無法用歸一化法測定含量，用內(nèi)標(biāo)法則很方便。
缺點(diǎn)：加一個與雜質(zhì)量相當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物。加大進(jìn)樣量突出雜質(zhì)峰，測定雜質(zhì)峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，即可求出雜質(zhì)含量。但樣品配制比較麻煩和內(nèi)標(biāo)物不易找尋。
以氣相色譜為例，氣相色譜是用峰面積或者峰高來定量的。依據(jù)如下：
1、最重要的第一條，就是檢測器的線性響應(yīng)關(guān)系。
在所有的色譜檢測器中，除了FPD之外，所有的檢測器都遵從線性響應(yīng)，也就是說m=KS。這里m指單位時間內(nèi)到達(dá)檢測器的待測物質(zhì)的量（包括質(zhì)量或物質(zhì)的量），K表示線性響應(yīng)系數(shù)，S表示檢測器響應(yīng)信號的值。也就是說，檢測器響應(yīng)信號的大小與單位時間到達(dá)檢測器的被測物質(zhì)的總量成正比。當(dāng)然我們也知道，這個關(guān)系是有范圍的，量太大或者太小，都會脫離線性。
2、其次就是第二條，塔板理論。塔板理論充分闡述了峰高與進(jìn)樣量之間的關(guān)系，或者說他們之間是成正比的。這個可以參考對塔板理論的說明。
根據(jù)這兩條，可以肯定的說待測物質(zhì)的峰高與待測物的進(jìn)樣總量成正比�；蛘呃梦⒎e分可以推斷出待測物質(zhì)的峰面積和待測物的進(jìn)樣總量成正比。既然峰高和峰面積都與進(jìn)樣總量成正比，為什么我們喜歡用峰面積，而不是更簡單的峰高呢？這個問題也很簡單，因?yàn)樗謇碚摬煌耆_，峰形經(jīng)常不完全滿足正態(tài)分布，所以峰高的代表性不足。什么時候峰高能夠有良好的代表性？很明顯，峰形良好而且對稱，成良好的正態(tài)分布曲線形狀的時候，或者說峰形尖銳且對稱的時候。色譜峰經(jīng)常拖尾，所以用峰面積定量就可以了，峰面積絕大多數(shù)情形下都具有很好的代表性。但是在檢測器超載，或模數(shù)轉(zhuǎn)換器超載，或峰面積積分不準(zhǔn)，或進(jìn)樣代表性不足，以及一些其他特殊情形下，用峰面積也不能得到正確結(jié)果。但無論如何，用峰面積定量已經(jīng)是我們可實(shí)行的最準(zhǔn)確方法了。
色譜定量分析，顧名思義就是色譜分析方法來測定組分的含量，主要分為面積百分比法、歸一化法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)加入法，色譜定量分析首先需要明確的概念是響應(yīng)因子，不同的化合物在檢測器的響應(yīng)是不一樣的，簡單地舉個例子說，相同濃度的化合物A和B，相同的進(jìn)樣量，得到的峰高和峰面積不一定一樣的，響應(yīng)因子的計(jì)算式如下：
式中，w為化合物的含量，A為響應(yīng)值，一般為峰面積或峰高，以峰面積為例。
由于不同的化合物在同一個檢測器的響應(yīng)因子不同，甚至同一個化合物不同濃度在同一檢測器的響應(yīng)因子不同，簡單地說就是化合物在檢測器的響應(yīng)不呈線性，或者線性范圍比較窄。選擇合適的定量方法時，除需要考慮是相對定量還是絕對定量外，同時需要考察化合物的線性響應(yīng)范圍、是否有合適內(nèi)標(biāo)、是否有標(biāo)準(zhǔn)品等。接下來就主要介紹下色譜分析中常用的三種定量方法：面積歸一化法、外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。
01
歸一化法
由于組分的量與其峰面積成正比，如果樣品中所有組分都能產(chǎn)生信號，得到相應(yīng)的色譜峰，那么可以用如下歸一化公式計(jì)算各組分的含量。
若樣品中各組分的校正因子相近，可將校正因子消去，直接用峰面積歸一化進(jìn)行計(jì)算。中國藥典用不加校正因子的面積歸一化法測定藥物中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度。
優(yōu)點(diǎn)：簡便、準(zhǔn)確、定量結(jié)果與進(jìn)樣量重復(fù)性無關(guān)(在色譜柱不超載的范圍內(nèi))、操作條件略有變化時對結(jié)果影響較小。
缺點(diǎn)：必須所有組分在一個分析周期內(nèi)都流出色譜柱，而且檢測器對它們都產(chǎn)生信號。不適于微量雜質(zhì)的含量測定。
缺點(diǎn)：必須所有組分在一個分析周期內(nèi)都流出色譜柱，而且檢測器對它們都產(chǎn)生信號。不適于微量雜質(zhì)的含量測定。
02
外標(biāo)法
用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號相比較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。
工作曲線法是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度，或用回歸方程計(jì)算，工作曲線法也可以用外標(biāo)二點(diǎn)法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標(biāo)一點(diǎn)法(直接比較法)定量。
工作曲線法是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度，或用回歸方程計(jì)算，工作曲線法也可以用外標(biāo)二點(diǎn)法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標(biāo)一點(diǎn)法(直接比較法)定量。
外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣，測得峰面積的平均值，用下式計(jì)算樣品中i組分的量：
式中Wi與Ai分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。Ws及As分別代表在對照品溶液進(jìn)樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。
優(yōu)點(diǎn)：簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對待測組分定量。
缺點(diǎn)：此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響。
此外，為了降低外標(biāo)一點(diǎn)法的實(shí)驗(yàn)誤差，應(yīng)盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。
03
內(nèi)標(biāo)法
選擇樣品中不含有的純物質(zhì)作為對照物質(zhì)加入待測樣品溶液中，以待測組分和對照物質(zhì)的響應(yīng)信號對比，測定待測組分含量的方法稱為內(nèi)標(biāo)法�！皟�(nèi)標(biāo)”的由來是因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)(對照)物質(zhì)加入到樣品中，有別于外標(biāo)法。該對照物質(zhì)稱為內(nèi)標(biāo)物。
在一個分析周期內(nèi)不是所有組分都能流出色譜柱(如有難氣化組分)，或檢測器不能對每個組分都產(chǎn)生信號，或只需測定混合物中某幾個組分的含量時，可采用內(nèi)標(biāo)法。
在一個分析周期內(nèi)不是所有組分都能流出色譜柱(如有難氣化組分)，或檢測器不能對每個組分都產(chǎn)生信號，或只需測定混合物中某幾個組分的含量時，可采用內(nèi)標(biāo)法。
準(zhǔn)確稱量W克樣品，再準(zhǔn)確稱量Ws克內(nèi)標(biāo)物，加入至樣品中，混勻，進(jìn)樣。測量待測組分i的峰面積Ai及內(nèi)標(biāo)物的峰面積As，則i組分在W克樣品中所含的重量Wi，與內(nèi)標(biāo)物的重量Wi，有下述關(guān)系：
待測組分i在樣品中的百分含量Ci％為：
對內(nèi)標(biāo)物的要求：①內(nèi)標(biāo)物是原樣品中不含有的組分，否則會使峰重疊而無法準(zhǔn)確測量內(nèi)標(biāo)物的峰面積；②內(nèi)標(biāo)物的保留時間應(yīng)與待測組分相近，但彼此能完全分離(R≥1.5)；③內(nèi)標(biāo)物必須是純度合乎要求的純物質(zhì)。
優(yōu)點(diǎn)：①在進(jìn)樣量不超限(色譜柱不超載)的范圍內(nèi)，定量結(jié)果與進(jìn)樣量的重復(fù)性無關(guān)。②只要被測組分及內(nèi)標(biāo)物出峰，且分離度合乎要求，就可定量，與其他組分是否出峰無關(guān)。③很適用于測定藥物中微量有效成分或雜質(zhì)的含量。由于雜質(zhì)(或微量組分)與主要成分含量相差懸殊，無法用歸一化法測定含量，用內(nèi)標(biāo)法則很方便。
缺點(diǎn)：加一個與雜質(zhì)量相當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物。加大進(jìn)樣量突出雜質(zhì)峰，測定雜質(zhì)峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，即可求出雜質(zhì)含量。但樣品配制比較麻煩和內(nèi)標(biāo)物不易找尋。
04
標(biāo)準(zhǔn)加入法
標(biāo)準(zhǔn)加入法實(shí)質(zhì)上是一種特殊的內(nèi)標(biāo)法，是以待測組分的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加入前后待測組分的峰面積（或峰高），從而計(jì)算出樣品中待測組分的含量。以峰面積計(jì)算方法為例，標(biāo)準(zhǔn)加入法的計(jì)算如下：
式中，Δwi為加入的標(biāo)準(zhǔn)品的量，Ai為待測組分的峰面積，ΔAi為加入標(biāo)準(zhǔn)品后待測組分峰面積的增加量，wi為原樣品中待測組分的含量。
無論是何種定量計(jì)算方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)，沒有一種方法是一勞永逸，還應(yīng)該根據(jù)樣品情況，具體情況具體選擇。
