C18的選用主要考慮2個(gè)問題，即柱填料和柱規(guī)格對色譜柱的影響。

1.1 C18柱的填料對色譜柱的影響　

柱填料的物理性能對填料色譜行為有重要影響。填料主要的物理性能包括如下：顆粒度、孔徑、孔體積、鍵合相化學(xué)、含碳量及烷基化處理。

(1)顆粒度是指柱填料的顆粒直徑的大小。實(shí)際上色譜柱上所標(biāo)的粒徑是一個(gè)平均值。如粒徑“5μm”并不是柱中填料所有的顆粒直徑都是5μm，實(shí)際上有一個(gè)顆粒分布度。這種分布度對柱反壓及柱效有重要作用。一般來說，平均顆粒度越小，顆粒分布度越小，色譜柱效越高，反壓亦越高。目前C18柱填料粒徑在4～10μm之間。

(2) 孔徑是指填料顆粒間的孔間隙。一般所說的孔徑是指填料的平均孔徑。球形填料裝柱后平均孔徑分布比較窄，柱床結(jié)構(gòu)均勻，柱效高，重現(xiàn)性好；無定形填料平均孔徑分布較寬，柱床結(jié)構(gòu)不均勻，流動(dòng)相線性速度不均勻，譜帶擴(kuò)寬。平均孔徑的大小對分離大分子化合物有較大的影響，在分離含有較大分子的樣品時(shí)可能會(huì)有分子排阻效應(yīng)，或產(chǎn)生吸附效應(yīng)從而影響定量的回收率及準(zhǔn)確度。因而在用反相色譜分離諸如蛋白或多肽樣品時(shí)應(yīng)考慮選用大孔徑(如30nm)的反相柱填料�？左w積作為硅膠多孔性的參數(shù)，在分離分析較大分子化合物時(shí)可作參考，選用較大孔體積的反相柱填料。

(3)化學(xué)鍵合相填料在高效液相色譜法中占有極重要的地位。它可以鍵合極性較大的有機(jī)基團(tuán)，采用極性較小的溶劑作流動(dòng)相。亦可鍵合極性較小的有機(jī)基團(tuán)，選用極性較大的溶劑作流動(dòng)相。C18色譜柱是以硅烷化鍵合型(Si-O-Si-C)存在的，這類鍵合反應(yīng)目前應(yīng)用最為普遍。如以十八烷基三氯硅烷與全多孔型硅膠M-Porasil-C18反應(yīng)生成烷基化學(xué)鍵合相，商品名為M-Bondapak-C18

(4)碳含量即填料中的含碳量。傳統(tǒng)的測量技術(shù)是將填料加熱到碳?xì)滏I斷裂，然后通過測定損失的重量或形成的二氧化碳來計(jì)算碳含量�？梢酝ㄟ^增加碳鍵的長度或增加鍵合密度來增加碳含量。碳含量增加，柱子的保留值增加。鍵合相的色譜行為與鍵合密度有關(guān)，也與硅膠的密度及填料的表面積有關(guān)，填料的密度越高，填柱所需的硅膠量越多，柱子的含碳量也越高。如果用2種不同密度相同碳含量的填料填充柱子，其保留行為將明顯不同。因此，單獨(dú)以碳含量來預(yù)測色譜行為是不夠的。

(5)C18硅烷化試劑是一個(gè)大于2nm大分子，因此會(huì)與已鍵合在相鄰的硅醇基上的C18硅烷化試劑產(chǎn)生嚴(yán)重的立體位阻。其結(jié)果導(dǎo)致在硅膠表面有大量的殘留硅醇基沒有與硅烷化試劑反應(yīng)，這些極性的硅醇基在一定色譜條件下會(huì)與堿性化合物相互作用引起峰形拖尾，從而可影響定量分析結(jié)果。這些問題在一定程度上可以通過烷基化處理加以克服。烷基化處理是在鍵合相上完成的獨(dú)立反應(yīng)，以減少在硅膠表面的硅醇基。烷基化處理采用小分子(如三甲硅烷)的試劑，其空間位阻遠(yuǎn)小于C18基團(tuán)。大多數(shù)固定相僅有30%可覆蓋的鍵合位置。據(jù)報(bào)道，通過某些極活躍的化學(xué)試劑及特殊的反應(yīng)條件，最高的覆蓋量可達(dá)50%。很好地了解硅膠鍵合相的物理特性將有助于在高效液相色譜的反應(yīng)中選擇合適的色譜柱。表面上看C18柱雖然化學(xué)官能團(tuán)相同，而實(shí)際上不同品牌的C18柱性能可能有很大差別，從而產(chǎn)生不同的分離結(jié)果。

1.2 C18柱的規(guī)格對色譜柱的影響　

柱填料的選擇關(guān)系到色譜分離的可能性，而柱規(guī)格的選擇直接影響分析速度、分離能力、檢測能力及每次分析的溶劑消耗等。柱規(guī)格包括兩方面：柱內(nèi)徑和柱長度。柱內(nèi)徑，分析型一般為2～6mm,制備型20mm，大者可達(dá)80mm；柱長度，分析型5～30cm，制備型15～50cm。一般來說，柱內(nèi)徑不影響分離度與分析時(shí)間的關(guān)系。今天，柱技術(shù)已發(fā)展到不同柱內(nèi)徑的柱子能夠具有相同的性能。不同內(nèi)徑的柱子又各具特點(diǎn)，對相同的分析時(shí)間和分離度來說，內(nèi)徑大的柱子比內(nèi)徑小的柱子多消耗溶劑。另一方面，較小內(nèi)徑的柱子對相同的檢測信號來說所需樣品量亦較少。因此，在樣品量有限時(shí)，可使用小內(nèi)徑柱。柱長度增加雖可改善分離效果，但阻力也隨之增加，必須提高入口壓力。柱壓是同時(shí)影響增加分離度和減少分析時(shí)間的主要障礙。分離度、分析時(shí)間及柱壓三者相互制約，選擇好其中兩者，則第3個(gè)因素也就選好了。長柱可以給出高分離度，短柱可提供快速分離，我們可以根據(jù)樣品情況去選用合適的色譜柱

1.3 C18柱選用的基本原則　

(1)選用經(jīng)過烷基化處理封口的填料可防止堿性化合物的拖尾現(xiàn)象。

(2)選用含碳量高的柱子，增加保留值。

(3)選用較短的柱子(如15cm，7.5cm)。

(4)選用小顆粒度的填料。

(5)對分子量大的組分選用大孔徑填料的柱子。

在日常分離分析工作中，色譜柱使用是否得當(dāng)，直接影響色譜柱的壽命。下面介紹C18柱在日常使用過程中應(yīng)注意的事項(xiàng)。

(1)柱子在裝卸、更換時(shí)，動(dòng)作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強(qiáng)的機(jī)械振動(dòng)，以免柱床產(chǎn)生空隙。

(2)如果儀器用來做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數(shù)多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置1根專用柱，這樣有助于延長柱子的壽命。

(3)如使用柱溫控制裝置時(shí)，應(yīng)注意在通入流動(dòng)相后才能升溫。

(4)流動(dòng)相使用前需進(jìn)行脫氣處理，以免降低柱效和影響檢測等。樣品溶液需經(jīng)適當(dāng)?shù)那疤幚砑斑^濾，以減少柱污染和堵塞。

(5)在更換流動(dòng)相種類時(shí)，應(yīng)注意溶劑的互溶性，防止發(fā)生鹽析現(xiàn)象。

(6)柱子的實(shí)際操作壓力應(yīng)低于填裝時(shí)的最高壓力，最好在最高壓力一半以下。一般不超過20593.965～29419.95 kPa。在低壓力(≤14 709.975kPa)的范圍使用，可使柱保持長時(shí)期的高柱效。

(7)C18色譜柱屬非極性鍵合相色譜柱，流動(dòng)相的pH值應(yīng)嚴(yán)格控制在2～7之間，以免損壞柱子。

(8)在完成分離分析工作之后，不應(yīng)立即停機(jī)，需及時(shí)對色譜分析系統(tǒng)進(jìn)行沖洗，一般0.5 h以上，以除去色譜柱內(nèi)的雜質(zhì)。

(9)如果流動(dòng)相中有鹽類，首先用水充分清洗。如果是胺類(如三甲胺類或四丁基胺類)添加到流動(dòng)相中，要用50%甲醇和0.05%磷酸溶液混合溶劑沖洗，不要只用水沖洗。

(10)C18一般用100%甲醇作為保存溶劑，以防柱子干裂而損壞。嚴(yán)禁水或緩沖溶液長時(shí)間在色譜流路中保留。

(11)選用合適的C18保護(hù)柱，以保護(hù)分析柱免受雜質(zhì)顆粒及不可逆吸附的干擾物的影響。保護(hù)柱內(nèi)裝填料顆粒度應(yīng)與分析柱填料的顆粒度盡量一致。

(12)柱的保存期不宜太長。短期不用的C18柱，用甲醇沖洗30～60min，然后將柱兩端密封。較長期不用的柱子，一是采取定期沖洗，再密封的方法；二是在沖洗后，柱兩端各裝1只有一定容量的灌滿甲醇的容器(只裝一端也可)，以補(bǔ)充在較長存放期間柱內(nèi)溶劑的蒸發(fā)。

色譜柱在日常使用過程中，盡管保護(hù)嚴(yán)格，樣品和流動(dòng)相盡管經(jīng)過前處理，但經(jīng)過長時(shí)間的使用，仍然難以完全避免柱子受到污染，固定相流失、板結(jié)、柱床塌陷以及柱效下降等。有些可以通過維修，使部分柱效恢復(fù)。

3.1　柱污染再生技術(shù)　

色譜柱污染后，可以用合適的溶劑沖洗，使柱效再生。C18柱常規(guī)的再生洗滌方法是：分別用甲醇、三氯甲烷、甲醇/水各60mL依次通過色譜柱，再用100%甲醇60mL平衡色譜柱后封存，柱效將恢復(fù)正常。必要時(shí)，根據(jù)柱污染性質(zhì)(如有機(jī)污染、鹽類污染等)，采用0.05 mol/L H2SO4、0.5 mol/L H3PO4或0.1 mol/L EDTA鈉鹽沖洗，然后再用水沖洗，最后用100%甲醇平衡色譜柱后封存。對于嚴(yán)重污染的C18柱，可采用水、甲醇、氯仿、乙烷依次沖洗后，按順序倒過來再?zèng)_洗1次，每次所用溶劑60mL，不接檢測器，最后用100%甲醇平衡色譜柱封存。

3.2　柱污染的修復(fù)　

在柱污染再生無效或已知柱污染嚴(yán)重時(shí)，可以采用柱修補(bǔ)的方法解決，但柱污染深度不宜超過5 mm。方法是將特制小鏟將污染部分挖去，再用與柱填料相同的固定相與流動(dòng)相混合制成漿狀，然后將漿狀固定相仔細(xì)補(bǔ)入被挖去的部分(盡量使后填補(bǔ)的固定相接近原裝的緊密程度)，修平端面即可。修好的柱子如果柱頭兩端的篩板的孔徑是一致的，可將柱子顛倒過來使用一般時(shí)間，目的是借助流動(dòng)相沖洗作用，恢復(fù)柱床緊密程度。

3.3　柱塌陷的修復(fù)　

柱塌陷的原因很多。對于塌陷不太嚴(yán)重時(shí)，如果柱頭兩端的篩板孔徑是一致的，可將柱顛倒使用一般時(shí)間，即可恢復(fù)性能。當(dāng)塌陷嚴(yán)重(5mm左右)時(shí)，可采用柱污染的修復(fù)方法修補(bǔ)即可。