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我們在準備反相液相色譜的流動相時，甲醇和乙腈被廣泛用作有機溶劑。但是為什么有時候使用甲醇，而有時候使用乙腈呢？這兩種有機溶劑之間有什么區(qū)別呢？
一、乙腈＆甲醇的性質
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化學性質
乙腈是一種極性的不可電離非質子酸，由于存在由于存在C≡N，它可以帶來π-π相互作用，又因為氮原子具有高電負性，它也可以與另一分子形成氫鍵。甲醇是一種極性的可電離質子酸，它可以和另一個分子相互作用形成氫鍵。為什么甲醇也可以形成氫鍵呢？因為甲醇上有-OH的存在，氧是高電負性原子，它可以部分極化分子。它在氧上產生微負電荷，在氫原子上產生微正電荷。因此，這個微正電荷的氫原子可以與微負電荷的原子形成氫鍵。
那么什么是極性可電離質子溶劑？極性可電離質子溶劑指的是具有氫原子與氧（如羥基）、氮（如胺基）或氟（如氟化氫）結合的溶劑。乙腈中存在氫原子，但這些氫原子不與氧形成氫鍵，因此，不能說乙腈是可電離的極性溶劑。而甲醇，氫原子可以與氧形成氫鍵，因此，甲醇是可電離極性溶劑。
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截止波長
當使用這些有機溶劑配制流動相，選擇檢測波長時，了解它們的紫外截止波長是非常重要的。乙腈與甲醇相比，它的截止波長更低，約為190nm，而甲醇約為210nm，這意味著使用乙腈時可以在190nm的低波長下進行檢測，但使用甲醇作為有機溶劑，可能無法使用低于210nm的波長，因為此時會產生很多基線噪音。
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經濟成本
另一個重要因素是甲醇和乙腈的經濟成本。乙腈價格高于甲醇，因此當有可能使用甲醇代替乙腈時，可以使用甲醇以節(jié)省實驗室成本。
二、有機溶劑比與柱壓的關系
我們的HPLC系統(tǒng)一般能承受的背壓約為4000psi，超過這個數(shù)值泵就無法工作。因此，應優(yōu)先選擇產生最小背壓的流動相。有機溶劑和背壓之間存在怎樣的關系呢？在上圖中，使用色譜柱：ODS（150mm×4.6mm，5μm），流 速：1.0ml/min，比較了乙腈與水和甲醇與水混合物在不同條件的壓力。由于較高的溫度導致溶劑的粘度降低，壓力也趨向降低。將柱溫設置在25~40℃之間進行比較，我們可以看到甲醇的壓力更高。因此，將流動相中的乙腈替換為甲醇時，需要重新評估儀器系統(tǒng)和色譜柱的耐壓能力。
三、乙腈＆甲醇的溶劑強度比較
現(xiàn)在我們來了解一下這兩種重要有機溶劑的強度。圖3展示了使用ODS柱分離對羥基苯甲酸類化合物（即對羥基苯甲酸酯）的一個例子�？梢钥闯霎斠译婧图状家韵嗤谋壤c水混合時，乙腈流動相的洗脫強度更大。圖4中的等效溶劑強度示意圖有助于在這些溶劑之間進行轉換時近似計算洗脫強度。例如，如果我們先前使用的是50/50（體積比）的乙腈/水作為流動相，在轉換為甲醇時，等效的甲醇/水比例將為60/40（體積比）。
圖3中分析的是以下6種分析物：甲基對羥基苯甲酸酯，乙基對羥基苯甲酸酯，異丙基對羥基苯甲酸酯、丙基對羥基苯甲酸酯、異丁基對羥基苯甲酸酯以及正丁基對羥基苯甲酸酯。這些對羥基苯甲酸酯在甲醇中的流動相中，它們都可以被有效地保留，但是當換成到乙腈時，保留時間會大大降低。這個實驗證明了乙腈在反相液相色譜中的洗脫能力更強。
那么為什么甲基對羥基苯甲酸酯會先洗脫出來，而正丁基對羥基苯甲酸酯卻最后才洗脫出來？看一下甲基對羥基苯甲酸酯和丁基對羥基苯甲酸酯的結構，甲基對羥基苯甲酸酯的碳鏈長度較短，而正丁基對羥基苯甲酸酯的碳鏈長度較長。碳鏈長度的變化會影響化合物的非極性，碳鏈較短的化合物非極性較弱，因此在這種情況下，可以清楚地看到正丁基對羥基苯甲酸酯與甲基對羥基苯甲酸酯相比非極性更強。
我們使用的是Shim-Pack ODS色譜柱，C18色譜柱的保留是由疏水或非極性相互作用所決定的。非極性化合物會在C18固定相上相互作用或保留更長時間，在這種情況下，由于正丁基對羥基苯甲酸酯具有更高的非極性特性，它會在C18固定相上保留更長時間。
四、乙腈＆甲醇洗脫選擇性的差異
下一個重要的點是甲醇和乙腈之間的洗脫選擇性不同，我將根據(jù)苯酚、苯甲酸和對甲苯酸的洗脫來解釋這兩種不同的選擇性。甲醇的流動相是緩沖液：甲醇（40:60），而乙腈的流動相是緩沖液：乙腈（60:40）。使用的色譜柱是Shim-pack VP-ODS，在這種情況下，我們會發(fā)現(xiàn)用甲醇時，苯酚首先洗脫，然后是苯甲酸，最后是對甲苯酸，但是在乙腈的條件下，會發(fā)現(xiàn)苯甲酸首先洗脫，然后是苯酚，最后是對甲苯酸。那么為什么用乙腈更容易洗脫苯甲酸呢？是什么使苯甲酸先于苯酚洗脫？
在這種情況下，我們需要了解苯甲酸與乙腈之間存在額外的相互作用，即與乙腈的碳氮三鍵和苯甲酸上的羰基氧上的π電子的π-π相互作用。因為甲醇不含π電子，因此這種π-π相互作用在甲醇中是不存在的，但在乙腈中卻很可能發(fā)生，并且由于這種額外的相互作用，苯甲酸將更喜歡存在于乙腈的流動相中。因此，它將隨著流動相一起流動，因此更快地洗脫出來。為什么對甲苯甲酸的保留時間較長？烷基鏈的存在將疏水性帶入分子中，如果疏水性存在，則可以通過疏水相互作用與C18固定相發(fā)生相互作用�，F(xiàn)在，在苯酚、苯甲酸中沒有烷基鏈的存在，但是在對甲苯甲酸的情況下，有一個甲基鏈，這個甲基鏈帶來了一點疏水性，因此會與C18等疏水性固定相發(fā)生相互作用，這導致對甲苯甲酸與固定相之間有很好的相互作用，因此會保留更長時間。
五、將乙腈＆甲醇與緩沖液混合產生的沉淀
在反相液相色譜中，緩沖液與有機溶劑的流動相混合使用，此時有機溶劑的濃度過高可能會導致緩沖鹽沉淀。上表中，分別展示了常用緩沖液與乙腈或甲醇混合后是否會沉淀的情況。我們可以看到，對于某些緩沖液，無論使用哪種有機溶劑都不會發(fā)生沉淀，但通常情況下，在甲醇條件下產生沉淀的情況較少。
六、與水混合產生的反應熱
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當甲醇與水混合時，會放出熱量；
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當乙腈與水混合時，會吸收熱量；
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隨著乙腈混合物逐漸回到室溫，液體中會產生氣泡；
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甲醇與水混合時會產生熱量，具有脫氣效果；
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配制水和甲醇混合物作為流動相時需要的關注比乙腈更少。
