因限制性內(nèi)切酶在DNA鏈上的切口是以特異序列為基礎(chǔ)的,核苷酸序列不同的DNA,經(jīng)酶切后就會產(chǎn)生不同長度的DNA片段,由此而構(gòu)成獨特的酶切圖譜。因此，DNA物理圖譜是DNA分子結(jié)構(gòu)的特征之一。DNA是很大的分子,由限制酶產(chǎn)生的用于測序反應(yīng)的DNA片段只是其中的極小部分,這些片段在DNA鏈中所處的位置關(guān)系是應(yīng)該首先解決的問題,故DNA物理圖譜是順序測定的基礎(chǔ),也可理解為指導(dǎo)DNA測序的藍圖。廣義地說,DNA測序從物理圖譜制作開始,它是測序工作的第一步。制作DNA物理圖譜的方法有多種,這里選擇一種常用的簡便方法──標記片段的部分酶解法,來說明圖譜制作原理。
用部分酶解法測定DNA物理圖譜包括兩個基本步驟:
(1)完全降解：選擇合適的限制性內(nèi)切酶將待測DNA鏈(已經(jīng)標記放射性同位素)完全降解,降解產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后進行自顯影,獲得的圖譜即為組成該DNA鏈的酶切片段的數(shù)目和大小。
(2)部分降解：以末端標記使待測DNA的一條鏈帶上示蹤同位素,然后用上述相同酶部分降解該DNA鏈,即通過控制反應(yīng)條件使DNA鏈上該酶的切口隨機斷裂,而避免所有切口斷裂的完全降解發(fā)生。部分酶解產(chǎn)物同樣進行電泳分離及自顯影。比較上述二步的自顯影圖譜,根據(jù)片段大小及彼此間的差異即可排出酶切片段在DNA鏈上的位置。下面是測定某組蛋白基因DNA物理圖譜的詳細說明。
該基因全長5900bp,用限制酶HpaⅡ完全降解該DNA可產(chǎn)生五個大小不等的片段,電泳分離并參照已知分子量的標準DNA帶,得知這些片段的大小分別為1930、1690、1020、950和310bp。不難推測該DNA上有四個HpaⅡ切口,但切口的位置和這五個片段在完整基因中的排列順序此時尚無法知道。接著將末端標記的該DNA片段進行HpaⅡ的部分降解,由于各切口隨機斷裂,產(chǎn)生的片段數(shù)顯然會多于完全降解產(chǎn)物。但電泳后的自顯影圖上只可能出現(xiàn)末端標記的DNA片段。若以待測DNA在左端為標記處,那么自顯影圖上將呈現(xiàn)4210、3260、2950和1020bp四條帶。其中最小片段（1020bp）與完全降解產(chǎn)物為同一片段，它應(yīng)定位于該基因的左端；而最大片段（4210bp）與完整基因（5900bp）之差的片段（1690bp）無疑應(yīng)定位于該基因的右端；余下的三個片段（1930、930和310bp）的定位，根據(jù)部分酶解的相鄰片段之差很易確定。據(jù)此推出的這五個片段在該基因上的排列順序是（左→右）:1020-1930-310-950-1690。物理圖譜與DNA測序的原理頗為相似，二者是通過片段長度來推測位置，所不同的是測序確定核苷酸（堿基）的位置，而此處是確定某個片段的位置。DNA物理圖譜測定后,便可對每一酶切片段進行核苷酸順序分析。在測定了所有片段的DNA順序后,根據(jù)物理圖譜將各片段"拼湊"起來就得出了待測DNA鏈的全部核苷酸順序�；虻娜樞驕y定才是我們要達到目的,一般人類基因的長度都在10Kb以上,巨大基因可長達200Kb,要完成基因的全順序測定需進行大量的工作。完成這些工作可采取多種不同的方法,但其基本思路是一致的,即在確定物理圖譜的基礎(chǔ)上,再進行DNA順序測定。
