1．標(biāo)記DNA探針 每次標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)可標(biāo)記10ng至3μg線性的DNA，也可標(biāo)記更大量的DNA，但所有的成分和體積要相應(yīng)增加。
（1）DNA探針熱變性，煮沸10min，迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上，待用。
（2）取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上，加下列及試劑：
新鮮變性的DNA 1-3μg
六聚核苷酸混合物 2μl（管5）
dNTP標(biāo)記用混合底物 2μl（管6）
加無菌重蒸水至 19μl
DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow） 1μl（管7）
（3）在37℃保溫至少60min，可到20h。
�。�4）煮沸5min，終止反應(yīng)。
（5）15000rpm離心30s，置于冰上待用。
2．預(yù)雜交 按100cm2膜用20～40ml預(yù)雜交溶液，預(yù)雜交時(shí)使溶液處于流動(dòng)狀態(tài)。
預(yù)雜交液組成：5×SSC
0.5%（W/V）封阻試劑（管11）
0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉
0.02%（W/V）SDS
膜放入塑料袋，灌入預(yù)雜交液，排除氣體后密封，在65℃預(yù)雜交過夜。
3．雜交 按100cm2膜用2.5ml雜交液，雜交時(shí)偶爾搖動(dòng)雜交袋，使里面的溶液重新分配。
雜交液組成： 50%甲酰胺（V/V）
5%（W/V）封阻試劑
5×SSC
0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉
0．02%(W/V)SDS
新變性標(biāo)記DNA（150ng/ml）
雜交液取代預(yù)雜交液，替換間膜不能干，成功地替換應(yīng)是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過夜（16～20h）。
4．洗膜 按100cm2膜用250ml洗膜液計(jì)算。
�。�1）在室溫下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。
�。�2）在65℃條件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。
（3）在室溫下用2×SSC溶液漂洗1次。
5．免疫測(cè)定
�。�1）配制溶液
緩沖液1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃）
緩沖液2：0.5%(W/V)封阻試劑(管11),配制于緩沖液1中(封阻試劑不會(huì)快速溶解,因此應(yīng)預(yù)早1h前配制此溶液,將試劑溶于50～70℃,此溶液保持混濁)。
緩沖液3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。
緩沖液4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)
顯色溶液：新鮮配制，在10ml緩沖液3中，加45μlNBT溶液（管9）和35μlX-磷酸鹽緩沖液（管10）。
2． 顯色過程
A．膜在緩沖液1中短暫洗滌（1min）。
B．在100ml緩沖2中保溫30min。
C．再用緩沖液1短暫洗滌。
D.用緩沖液1稀釋的抗體結(jié)合物(管8)至150U/L(1:5000);稀釋后的抗體結(jié)合物在4℃只能穩(wěn)定12h。
E.膜在20ml稀釋的抗體結(jié)合物溶液中保溫30min。
F.用100ml緩沖液1洗膜,以除去未結(jié)合的抗體結(jié)合物,15min,2次。
G.膜在緩沖液3中平衡2min。
H.在黑暗條件下,膜與10ml顯色溶液放入塑料袋內(nèi)密封或放入合適的盒子內(nèi),幾分鐘內(nèi)開始出現(xiàn)顏色,一般顯色反應(yīng)在1天后全部完成。當(dāng)顏色顯影時(shí)，不可振蕩或攪拌。
I．當(dāng)要求的點(diǎn)或帶已被檢測(cè)時(shí)，可用50ml緩沖液4洗膜5min終止反應(yīng)。
J．?dāng)z相。
說明：上述各反應(yīng)均在室溫下進(jìn)行，除了顯色反應(yīng)外，均需振蕩或攪拌。
�。ㄎ澹┡懦龑�(shí)驗(yàn)中問題的方法
1．DNA不能有效地被標(biāo)記時(shí)考慮
（1）用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新純化DNA。
�。�2）標(biāo)記反應(yīng)的保溫時(shí)間延長(zhǎng)（增至20h）。
�。�3）DNA變性或許不完全，這時(shí)對(duì)大片段DNA特別重要。
2．不能達(dá)到預(yù)期的靈敏度時(shí)考慮
（1）DNA標(biāo)記率。
�。�2）增加標(biāo)記DNA的濃度或增加雜交時(shí)間。
（3）顯色反應(yīng)的時(shí)間可延長(zhǎng)至3d。
3．若顯色時(shí)背景過深，可采取
（1）在雜交溶液中減少標(biāo)記DNA量。
�。�2）增加雜交溶液的體積，使膜隨意漂浮在溶液中。
（3）某些類型的尼龍膜可能產(chǎn)生深色背景，因此可采用其它類型的尼龍膜或改用硝酸纖維素膜。
（4）在雜交和檢測(cè)過程中增加封阻試劑的濃度。
