離心是研究如細胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體,以及各種大分子基本手段。一般認為,轉(zhuǎn)速為10~25Kr/min的離心機稱為高速離心機;轉(zhuǎn)速超過25Kr/min,離心力大于89Kg者稱為超速離心機。目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100Kr/min,離心力超過500Kg。
(一)、差速離心(differential centrifugation)
在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心,用于分離不同大小的細胞和細胞器。
在差速離心中細胞器沉降的順序依次為:核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。
由于各種細胞器在大小和密度上相互重疊,而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中,一般重復(fù)2~3次效果會好一些。
差速離心只用于分離大小懸殊的細胞,更多用于分離細胞器。通過差速離心可將細胞器初步分離,常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。
速度逐漸提高,樣品按大小先后沉淀
(二)、密度梯度離心(density gradient centrifugation)
用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度,將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部,通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫,蔗糖和多聚蔗糖。分離活細胞的介質(zhì)要求:1)能產(chǎn)生密度梯度,且密度高時,粘度不高;2)PH中性或易調(diào)為中性;3)濃度大時滲透壓不大;4)對細胞無毒。
A等速度沉降,B等密度沉降
1、速度沉降
速度沉降(velocity sedimentation)主要用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。這種降方法所采用的介質(zhì)密度較低,介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。
生物顆粒(細胞或細器)在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。
2、等密度沉降
等密度沉降(isopycnic sedimentation)適用于分離密度不等的顆粒。
細胞或細胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處,并停留在那里達到平衡,從而將不同密度的細胞或細胞器分離。
等密度沉降通常在較高密度的介質(zhì)中進行。介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度,而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度,不能太平緩。再者,這種方法所需要的力場通常比速率沉降法大10~100倍,故往往需要高速或超速離心,離心時間也較長。大的離心力、長的離心時間都對細胞不利。大細胞比小細胞更易受高離心力的損傷,而且停留在等密度介質(zhì)中的細胞比處在移動中的細胞受到更大的損傷。因此,這種方法適于分離細胞器,而不太適于分離和純化細胞。