1 實驗室設計
細胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術,要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響.細胞培養(yǎng)室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響,要求工作環(huán)境清潔,空氣清新,干燥和無煙塵.細胞培養(yǎng)室的設計原則一般是無菌操作區(qū)設在室內較少走動的內側,常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室,而洗刷消毒在另一室.
2 常用設施及設備
(1)超凈工作臺:也稱凈化工作臺,分為側流式,直流式和外流式三大類.
(2)無菌操作間:一般由更衣間,緩沖間和操作間三部分組成.操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養(yǎng)箱,離心機,倒置顯微鏡等.緩沖間可放置電冰箱,冷藏器及消毒好的無菌物品等.
(3)操作間:普通培養(yǎng)箱,離心機,水浴鍋,定時鐘,普通天平及日常分析處理物
(4)洗刷消毒間:烤箱,消毒鍋,蒸餾水處理器及酸缸等.
(5)分析間:顯微鏡,計算機及打印機等.
3 培養(yǎng)器皿
常用細胞培養(yǎng)器皿有培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)板,培養(yǎng)皿等.常準備量是使用量的三倍.器皿應選擇透明度好,無毒,利于細胞粘附和生長的材料,常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品.常用的器皿有下面幾種.
(1)液體儲存瓶:用于儲存各種配制好的培養(yǎng)液,血清等液體,常用規(guī)格有500ml,250ml, 100ml等幾種.
(2)培養(yǎng)瓶:根據(jù)培養(yǎng)細胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異,用于細胞傳代培養(yǎng)的細胞要求瓶壁厚簿均勻,便于細胞貼壁生長和觀察,瓶口要大小一致,口徑一般不小于1cm,允許吸管伸入瓶內任何部位,規(guī)格有200ml,100ml,50ml,25ml,10ml等幾種.
(3)培養(yǎng)皿:用于開放式培養(yǎng)及其它用途.分直徑30mm,60mm,120mm等幾種.
(4)吸管:常用的有長吸管和短吸管兩類,長吸管也稱刻度吸管.其改良后管上部有球型刻度稱改良吸管,刻度吸管用于移動液體.常用1ml和10ml兩種.短吸管也叫滴管,分彎頭和直頭兩種.
(5)離心管:離心管是細胞培養(yǎng)中使用最廣泛的器皿,根據(jù)用途不同形態(tài)各樣,常用
于細胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類.前者分別為50ml,30ml,15ml;后者則多為10ml和5ml.
(6)其它:如三角燒瓶,燒杯,量筒,漏斗,注射器等.
4 細胞培養(yǎng)溫度
維持培養(yǎng)細胞旺盛生長,必須有恒定而適宜的溫度.不同種類的細胞對培養(yǎng)溫度要求也不同.人體細胞培養(yǎng)的標準溫度為36.5℃±0.5℃,偏離這一溫度范圍,細胞的正常代謝會受到影響,甚至死亡.培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力較對高溫強,溫度上升不超過39℃時,細胞代謝與溫度成正比;人體細胞在39-40℃1小時,即能受到一定損傷,但仍有可能恢復;在40-41℃1小時,細胞會普遍受到損傷,僅小半數(shù)有可能恢復;41-42℃1小時,細胞受到嚴重損傷,大部分細胞死亡,個別細胞仍有恢復可能;當溫度在43℃以上1小時,細胞全部死亡.相反,溫度不低于0℃時,對細胞代謝雖有影響,但并無傷害作用;把細胞放入25-35℃時,細胞仍能生存和生長,但速度減慢;放在4℃數(shù)小時后,再回到37℃培養(yǎng),細胞仍能繼續(xù)生長.細胞代謝隨溫度降低而減慢.當溫度降至冰點以
下時,細胞可因胞質結冰受損而死亡.但是,如果向培養(yǎng)液中加入一定量的冷凍保護劑
(二甲亞砜或甘油),可在深低溫下如-80℃或-196℃(液氮)長期保存.
5 合適的氣體環(huán)境
氣體是哺乳動物細胞培養(yǎng)生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和二氧化碳.氧氣參與三羧酸循環(huán),產(chǎn)生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分.開放培養(yǎng)時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中.二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物,也是細胞生長繁殖所需成分,它在細胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH值.大多數(shù)細胞的適宜pH為7.2-7.4,偏離這一范圍對細胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響.但細胞耐酸性比耐堿性大一些,在偏酸環(huán)境中更利于細胞生長.但有一些細胞也喜歡偏堿環(huán)境中生長,如成纖維細胞最適合pH是7.4-7.6.每種細胞都有其最適pH值.