1. 標(biāo)本采集 在無菌條件下于健康產(chǎn)婦分娩后立即取新生兒臍帶， 擠出臍帶血管中的血液，放入裝有含青鏈霉素的PBS液瓶中，2h之內(nèi)行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)。
雙抗：青霉素100u/ml; 鏈霉素100μl/ml
PBS：KCl 0.2 g/L, KH2PO4 0.24 g/L, NaCl 8.0g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L或Na2HPO4 1.44 g/L。 在800ml蒸餾水中加入上述質(zhì)量物質(zhì)，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高壓蒸汽滅菌20分鐘，室溫保存。
2. 原代血管內(nèi)皮細(xì)胞的獲取與培養(yǎng) 按Jaffe等人〔1〕的方法加以改進(jìn)。在無菌條件下取新生兒臍帶，剪去鉗痕和凝血塊阻塞部分，找到臍靜脈。一端插上帶有膠管的玻璃管結(jié)扎固定，經(jīng)膠管接注射器，用生理鹽水灌洗。待臍靜脈內(nèi)的殘血除凈后，用37℃ PBS，沖洗兩次，將另一端用鐵夾夾閉，向臍靜脈內(nèi)灌注0.25%胰蛋白酶8～10ml，夾閉膠管放入已滅菌的大平皿中。37℃孵育12min，在此期間經(jīng)常翻動(dòng)臍帶使酶溶液在血管內(nèi)流動(dòng)以促使內(nèi)皮細(xì)胞均勻與酶接觸。取出臍帶后輕輕擠壓管壁，將含有內(nèi)皮細(xì)胞的胰蛋白酶注入50ml錐形離心管中，加入小牛血清2ml終止酶反應(yīng)。再以30ml PBS沖洗管腔，流出液一并入離心管，1000r/min離心10min，棄上清，加入含有10%小牛血清的DMEM [或IMDM(Dibco)？]培養(yǎng)液，充分混合制成細(xì)胞懸液。取0.1ml細(xì)胞懸液在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。最后調(diào)細(xì)胞數(shù)，以1×105/ml接種至24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml。置于5%CO2，37℃靜止培養(yǎng)24h更換培養(yǎng)液，以除去未貼壁的細(xì)胞。以后每隔2d換液1次，以維持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。
胰蛋白酶溶液（100ml）配制：1）將D-Hanks（橙紅色）液高壓消毒滅菌，用NaHCO3液調(diào)節(jié)pH至7.2左右。 2）稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許消毒的鹽溶液調(diào)成糊狀，然后再補(bǔ)足鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4小時(shí)或冰箱內(nèi)過夜，并不時(shí)攪拌振蕩。 3）次日先用濾紙粗慮，再過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱或－20℃保存?zhèn)溆茫Ｓ脻舛葹?.25％或0.125％；胰蛋白酶溶液（深紅色）偏酸，使用前用NaHCO3調(diào)pH至7.2左右。
D－Hanks液配制：
KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06 g/L , NaCl 8.0g/L, NaHCO3 0.35 g/L,
Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, 酚紅 0.02 g/L
3．傳代內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 原代內(nèi)皮細(xì)胞融合后用培養(yǎng)液沖洗兩次，然后用0.25%胰酶加入到內(nèi)皮細(xì)胞中，每孔0.3ml。邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察。細(xì)胞皺縮、彼此分離或呈大片狀分離即可終止消化。加入含有10%小牛血清的培養(yǎng)液，吸管吹打，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按105個(gè)細(xì)胞/ml，繼續(xù)培養(yǎng)。
4．血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定 1）倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。2）VWF相關(guān)抗原免疫熒光檢查：在24孔塑料培養(yǎng)板孔內(nèi)放置無菌的蓋玻片0.5cm×0.6cm，每孔中種植1ml含有105個(gè)細(xì)胞的原代或傳代內(nèi)皮細(xì)胞懸液。待內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài)時(shí)，取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，投入冷丙酮中(-18～-20℃)，細(xì)胞面向上，作用7min，用PBS沖洗3次，每次1min，而后進(jìn)行間接免疫熒光檢查，第一抗體為鼠抗人VWF單克隆抗體(蘇州醫(yī)學(xué)院血栓室提供)，1∶20倍稀釋，加入50μl于蓋玻片上，放入濕盒內(nèi)4℃過夜。同時(shí)不加一抗做陰性對(duì)照。用PBS沖洗3次后，加入異硫氫酸標(biāo)記的二抗50μl(異硫氰酸標(biāo)記羊抗鼠IgG，北京)，放入37℃2h后，用PBS洗滌3次。然后立即在熒光顯微鏡下觀察，攝片。 血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定結(jié)果： VWF相關(guān)抗原間接免疫熒光檢查，原代及傳代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞漿中有黃綠色的熒光著色，胞核呈黑綠色，整個(gè)細(xì)胞輪廓清楚。作為對(duì)照的內(nèi)皮細(xì)胞片子中，偶見綠色斑點(diǎn)散發(fā)熒光，未見細(xì)胞輪廓。
5．內(nèi)皮細(xì)胞體外生長(zhǎng)情況 用胰蛋白酶消化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，接種在24孔塑料培養(yǎng)板各孔內(nèi)4h后，大部分細(xì)胞貼壁。早期細(xì)胞呈小多角、球形、呈團(tuán)狀，少數(shù)細(xì)胞伸展，48～72h生長(zhǎng)最快，逐漸生長(zhǎng)成梭形，有些細(xì)胞排列呈魚貫狀相連，間有旋禍狀排列。核清晰，呈圓形或橢圓形，核分裂相多見，1～2核仁，胞漿豐富，內(nèi)含小顆粒。于3～4d后融合，7～10d胞體呈多角形，相互嵌合，為單層呈鋪路石狀排列。