一、實驗目的

    了解血球計數(shù)板的構(gòu)造、計數(shù)原理和計數(shù)方法，掌握顯微鏡下直接計數(shù)的技能。

二、實驗原理

    測定微生物細胞數(shù)量的方法很多，通常采用的有顯微直接計數(shù)法和平板計數(shù)法。

    顯微計數(shù)法適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板，一般細菌則采用彼得羅夫·霍澤（Petrof Hausser）細菌計數(shù)板。兩種計數(shù)板的原理和部件相同，只是細菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計數(shù)板下部的細菌不易看清。

    血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)（圖21-1），計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)分為16個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同特點，即計數(shù)區(qū)都由400個小方格組成。

計數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計數(shù)區(qū)的面積為l mm²，每個小方格的面積為1/400mm²。蓋上蓋玻片后，計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm³，每個小方格的體積為1/4000mm³。

使用血球計數(shù)板計數(shù)時，先要測定每個小方格中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數(shù)量。

已知：1mm³體積=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm³

所以：1mm³體積應含有小方格數(shù)為1000mm³/1/4000mm³=4×10⁶個小方格，即系數(shù)K=4×10⁶ 。

因此：每ml菌懸液中含有細胞數(shù)= 每個小格中細胞平均數(shù)（N）×系數(shù)（K）×菌液稀釋倍數(shù)（d）

三、實驗器材

1．活材料：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培養(yǎng)液。

2．器材：顯微鏡、血球計數(shù)板、蓋玻片（22mm×22mm）、吸水紙、計數(shù)器、滴管、擦鏡紙。

四、實驗方法  

1．視待測菌懸液濃度，加無菌水適當稀釋（斜面一般稀釋到10^-2），以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。

2．取潔凈的血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。

3．將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數(shù)區(qū)上，不要使計數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數(shù)區(qū)深度的升高。然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。4．靜置片刻，將血球計數(shù)板置載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應減弱光照的強度。

5．計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16個大方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個大方格（即100小格）的菌數(shù)。如果是25個大方格組成的計數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個大方格外，還需數(shù)中央l個大方格的菌數(shù)（即80個小格）。如菌體位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。

6．對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復計數(shù)2—3次（每次數(shù)值不應相差過大，否則應重新操作），求出每一個小格中細胞平均數(shù)（N），按公式計算出每ml（g）菌懸液所含酵母菌細胞數(shù)量。

7．測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風機吹干，放入盒內(nèi)保存。

五、實驗作業(yè)：   

將實驗結(jié)果填入下表中：