一、原理
利用氨基酸的兩性作用，加人甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性。用氫氧化鈉標準溶液滴定后定量，以酸度計測定終點。

二、試劑
除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T 6682規(guī)定的三級水。
甲醛(36%~38%):應不含有聚合物(沒有沉淀且溶液不分層)。
酚酞。
乙醇。
鄰苯二甲酸氫鉀:基準物質(zhì)。

三、試劑配制
氫氧化鈉標準滴定溶液[c(NaOH)-0.050mol/L]:經(jīng)國家認證并授子標準物質(zhì)證書的標準滴定溶液或配制方法如下：
1、酚酞指示液:稱取酚酞1g溶于95%的乙醇中,用95%乙醇稀釋至100 mL。
2、氫氧化鈉溶液[氯氧化鈉標準滴定溶液c(NaOH)=0.05mol/L]：稱取110g氫氧化鈉于250mL的燒杯中，加100mL的水，振搖使之溶解成飽和溶液，冷卻后置于聚乙烯的塑料瓶中,密塞放置，澄清后備用。取上層清液2.7 mL加適量新煮沸過的冷蒸餾水至1000mL,搖勻。
3、氫氧化鈉標準滴定溶液的標定：準確稱取約0.36g在105℃~110℃干燥至恒重的基準鄰苯二甲酸氫鉀,加80mL新煮沸過的水,使之盡量溶解,加2滴酚酞指示液(10g/L),用氫氧化鈉溶液滴定至溶液呈微紅色,30s不褪色。記下耗用氫氧化鈉溶液毫升數(shù)。同時做空白試驗。
C＝m/( V1— V2)×0.2042………（1）
式中：
c-氫氧化鈉標準滴定溶液的實際濃度。單位為摩爾每升(mol/L)；
m-基準鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量。單位為克(g)；
V1-氯氧化鈉標準溶液的用量體積。單位為毫升(mL)；
V2-空白實驗中氫氧化鈉標準溶液的用量體積。單位為毫升(mL)；
0.2042--與1.00mL氫氧化鈉標準滴定溶液[e(NaOH)=1.000mol/L]相當?shù)幕鶞枢彵蕉�甲酸氫鉀的質(zhì)量。單位為克(g)。
四、儀器和設備
酸度計(附磁力攪拌器)。
10mL微量堿式滴定管。
分析天平:感量0.1mg。

五、分析步驟
1、醬油試樣
稱量5.0g試樣于50mL的燒杯中,用水分數(shù)次洗入100mL容量瓶中,加水至刻度，混勻后吸取20.0mL，置于200ml燒杯中，加60mL水，開動磁力攪拌器，用氫氧化鈉標準溶液[e(NaOH)=0.050mol/L]滴定至酸度計指示pH為8.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數(shù)，可計算總酸含量。加入10.0mL甲醛溶液,混勻。再用氯氧化鈉標準滴定溶液繼續(xù)滴定至pH為9.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數(shù)。同時取80ml水。先用氫氧化鈉標準溶液[e(NaOH)=0.050mol/L]調(diào)節(jié)至pH為8.2，再加人10.0mL甲醛溶液.用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至pH為9.2，做試劑空白試驗。
2、醬及黃豆醬樣品
將醬或黃豆醬樣品攪拌均勻后，放入研缽中，在10min內(nèi)迅速研磨至無肉眼可見顆粒,裝人磨口瓶中備用。用已知重量的稱量瓶稱取攪拌均勻的樣品5.0g用50mL80℃左右的燕餾水分數(shù)次洗入100mL燒杯中，冷卻后，轉(zhuǎn)人100mL容量瓶中，用少量水分次洗滌燒杯洗液并入容量瓶中并加水至刻度混勻后過能。吸取濾液10.0mL置于200mL燒杯中，加60mL水，開動磁力攪拌器，用氫氧化鈉標準溶液[e(NaOH)=0.050mol/L]滴定至酸度計指示pH為8.2記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數(shù),可計算總酸含量。加人10.0mL甲醛溶液混勻。再用氣氧化鈉標準滴定溶液繼續(xù)滴定至pH為9.2記下消耗氯氧化鈉標準滴定溶液的毫升數(shù)。同時取80mL水，先用氫氧化鈉標準溶液[e(NaOH)=0.050mol/L]調(diào)節(jié)至pH為8.2再加入10.0mL甲醛溶液,用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至pH為9.2做試劑空白試驗。

六、分析結(jié)果的表述
試樣中氨基酸態(tài)氨的含量按式(2)進行計算:
             X＝(V1— V2)×C×0.014×100/ m× V3/ V4………(2)
式中:
X一 試樣中氨基酸態(tài)氮的含量,單位為克每百克(g/100g)；
V1一測定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氯氧化鈉標準滴定溶液的體積，單位為毫升(mL)；
V2-試劑空白實驗加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積,單位為毫升(mL)；
C-氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度,單位為摩爾每升(mol/L)；
0.014--與1.00mL氫氧化鈉標準滴定溶液[<(NaOH)=1.000mol/L]相當?shù)牡�的質(zhì)量，單位為克(g)；
m-稱取試樣的質(zhì)量,單位為克(g)；
V3一試樣稀釋液的取用量,單位為毫升(mL)；
V4一試樣稀釋液的定容體積.單位為毫升(mL)；
100一單位換算系數(shù)。
計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

七、精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

B.第二法、比色法   

一、原理
在pH為4.8的乙酸鈉乙酸緩沖液中，氨基酸態(tài)氣與乙酰丙酮和甲醛反應生成黃色的3.5-二乙酸-2.6-二甲基-1.4二氫化吡啶氨基酸衍生物。在波長400nm處測定吸光度，與標準系列比較定量。

二、試劑和材料
除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T 6682規(guī)定的二級水。
試劑：
乙酸:無水乙酸鈉或乙酸鈉。
甲醇。
乙酰丙酮。

三、試劑配制
乙酸溶液(1mol/L)：量取5.8mL冰乙酸，加水稀釋至100mL。
乙酸鈉溶液(1mol/L)：稱取41g無水乙酸鈉或68g乙酸鈉。加水溶解后并稀釋至500mL。
乙酸鈉乙酸緩沖液：量取60mL乙酸鈉溶液(1mol/L)與40mL乙酸溶液(1mol/L)混合,該溶液pH為4.8。
顯色劑:15mL37%甲醇與7.8mL乙酰丙酮混合,加水稀釋至100mL,劇烈振搖混勻(室溫下放置穩(wěn)定3d)。

四、標準溶液配制
氨氮標準儲備溶液(1.0mg/mL)：精密稱取105℃干燥2h的硫酸銨0.4720g于小燒杯中，加水溶解后移至100mL容量瓶中，并稀釋至刻度，混勻。此溶液每毫升相當于1.0mg氨氮(10℃下冰箱內(nèi)貯存穩(wěn)定1年以上)。
氨氮標準使用溶液(0.1g/L):用移液管精確量取10mL。氨氮標準儲備液(1.0 mg/mL)于100mL容量瓶內(nèi)。加水稀釋至刻度,混勻,此溶液每毫升相當于100μg氨氮(10℃下冰箱內(nèi)貯存穩(wěn)定1個月)。

五、儀器和設備
分光光度計。
電熱恒溫水浴鍋(100℃士0.5℃)。
10mL具塞玻璃比色管。

六、分析步驟
1、試樣前處理
稱量1.00g試樣于50mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,混勻。
2、標準曲線的制作
精密吸取氨氮標準使用溶液0 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL分別于10 mL比色管中。向各比色管分別加人4mL乙酸鈉乙酸緩沖溶液(pH4.8)及4mL顯色劑，用水稀釋至刻度,混勻。置于100 ℃水浴中加熱15 min，取出，水浴冷卻至室溫后。移入1cm比色阻內(nèi)，以零管為參比,于波長400nm處測量吸光度。繪制標準曲線或計算直線回歸方程。
3、試樣的測定
精密吸取2 mL試樣稀釋溶液于10 mL比色管中。加入4 mL乙酸鈉乙酸緩沖溶液(pH4.8)及4 mL顯色劑,用水稀釋至刻度,混勻。置于100℃水浴中加熱15 min.取出,水浴冷卻至室溫后,移入1cm比色皿內(nèi)，以零管為參比，于波長400nm處測量吸光度。試樣吸光度與標準曲線比較定量或代人標準回歸方程.計算試樣含量。

七、分析結(jié)果的表述
試樣中氨基酸態(tài)氮的含量按式進行計算:
                 X＝m×100/ m1×1000×1000× V1/ V2………(3)
式中:
X一試樣中氨基酸態(tài)氮的含量，單位為克每百克(g/100 g)；
m-試樣測定液中氮的質(zhì)量，單位為微克(μg)；
m1-稱取試樣的質(zhì)量，單位為克(g)；
V1一測定用試樣溶液體積，單位為毫升(mL)；
V2-試樣前處理中的定容體積，單位為毫升(mL)；

八、精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

九、其他
本方法的檢出限為0.0070 mg/100 g。定量限為0.0210 mg/100g。
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