質(zhì)譜成像（Imaging Mass Spectrometry, IMS）這種最新原位分析技術(shù)主要是利用質(zhì)譜直接掃描生物樣品，分析分子在細(xì)胞或組織中的“結(jié)構(gòu)、空間與時(shí)間分布”信息。其基本流程（以質(zhì)譜分析生物組織標(biāo)記物為例）見下： 

簡(jiǎn)單而言，質(zhì)譜成像技術(shù)就是借助于質(zhì)譜的方法，再配套上專門的質(zhì)譜成像軟件控制下，使用一臺(tái)通過測(cè)定質(zhì)荷比來分析生物分子的標(biāo)準(zhǔn)分子量的質(zhì)譜儀來完成的。但是隨著這項(xiàng)技術(shù)的不斷發(fā)展，也陸續(xù)出現(xiàn)了許多針對(duì)各種問題的新技術(shù)。

最早的質(zhì)譜成像技術(shù)是基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI，matrix assisted laser desorption ionization）質(zhì)譜分子成像技術(shù)，由范德堡大學(xué)（Vanderbilt University）的Richard Caprioli等在1997年提出，他們通過將MALDI質(zhì)譜離子掃描技術(shù)與專業(yè)圖像處理軟件結(jié)合，直接分析生物組織切片，產(chǎn)生任意指定質(zhì)荷比（m/z）化合物的二維離子密度圖，對(duì)組織中化合物的組成、相對(duì)豐度及分布情況進(jìn)行高通量、全面、快速的分析，可通過所獲得的潛在的生物標(biāo)志物的空間分布以及目標(biāo)組織中候選藥物的分布信息，來進(jìn)行生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和化合物的監(jiān)控。

正如數(shù)字圖像包括三個(gè)通道：紅，綠，藍(lán)一樣（單個(gè)亮度定義了每個(gè)像素的顏色），質(zhì)譜成像也包含了數(shù)以千計(jì)的通道，每一個(gè)對(duì)應(yīng)于一個(gè)特殊的光譜峰值，“你可以通過質(zhì)譜方法從這些像素中獲得任何信號(hào)，然后調(diào)整圖像中所需分子像素的相對(duì)亮度，最后，得到一張分子特異性的成像圖。”

這種方法可用于小分子代謝物，藥物化合物，脂質(zhì)和蛋白，而且,質(zhì)譜成像能相對(duì)快速的利用許多分子通道，完全無需特殊抗體,下面列出五種先進(jìn)的質(zhì)譜成像方法。

I.挑戰(zhàn)高分子量蛋白——MALDI質(zhì)譜分子成像技術(shù)

在對(duì)組織或生物體進(jìn)行成像，分析小分子構(gòu)成的時(shí)候，有一個(gè)“攔路虎”總是阻礙實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程，那就是多肽，這些多肽體積十分大，要想對(duì)它們進(jìn)行分子成像幾乎是不可能的，比如，想要研究腫瘤邊緣的分子微環(huán)境，如果直接成像是不可能獲得清晰圖像的。

來自范德堡大學(xué)的質(zhì)譜方法專家Richard Caprioli博士因此發(fā)明了基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）質(zhì)譜分子成像技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)不局限于特異的一種或者幾種蛋白質(zhì)分子，它可在組織切片中找到每一種蛋白質(zhì)分子，并提供這些蛋白質(zhì)分子在組織中的空間分布的精確信息，而事先無需知道所檢測(cè)蛋白的信息。同時(shí)，可對(duì)這些蛋白質(zhì)分子含量進(jìn)行相對(duì)定量。

MALDI質(zhì)譜分子成像是在專門的質(zhì)譜成像軟件控制下，使用一臺(tái)通過測(cè)定質(zhì)荷比來分析生物分子的標(biāo)準(zhǔn)分子量的質(zhì)譜儀來完成的。被用來研究的組織首先經(jīng)過冰凍切片來獲得極薄的組織片，接著用基質(zhì)封閉組織切片并將切片置入質(zhì)譜儀的靶上。通過計(jì)算機(jī)屏幕觀察樣品，利用MALDI系統(tǒng)的質(zhì)譜成像軟件，選擇擬成像部分，首先定義圖像的尺寸，根據(jù)尺寸大小將圖像均分為若干點(diǎn)組成的二維點(diǎn)陣，來確定激光點(diǎn)轟擊的間距。激光束通過這個(gè)光柵圖案照射到靶盤上的組織切片，軟件控制開始采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在質(zhì)譜儀中，激光束對(duì)組織切片進(jìn)行連續(xù)的掃描，組織樣品在激光束的激發(fā)下釋放出的分子被質(zhì)譜儀所鑒定從而獲得樣品上每個(gè)點(diǎn)的質(zhì)荷比（m/z）信息，然后將各個(gè)點(diǎn)的分子量信息轉(zhuǎn)化為照片上的像素點(diǎn)。在每個(gè)點(diǎn)上，所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)平均化處理獲得一幅代表該區(qū)域內(nèi)化合物分布情況的完整質(zhì)譜圖。儀器逐步采集組織切片的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，最后得到具有空間信息的整套組織切片的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。這樣就可以完成對(duì)組織樣品的“分子成像”。設(shè)定m/z的范圍，即可確定該組織區(qū)域所含生物分子的種類，并選定峰高或者峰面積來代表生物分子的相對(duì)豐度。圖像中的彩色斑點(diǎn)代表化合物的定位，每個(gè)斑點(diǎn)顏色的深淺與激光在每一個(gè)點(diǎn)或像素上檢測(cè)到的信號(hào)大小相關(guān)。

通過增加單位面積上轟擊的激光點(diǎn)數(shù)量和像素，研究人員可以獲得更多的樣品信息，例如，采用4000像素比200像素能夠得到更好的樣品圖像。質(zhì)譜分子成像技術(shù)是一種半定量或相對(duì)定量技術(shù)，圖像上顏色深的部分表明有更多的生物分子聚集在組織的這個(gè)部分，然而，不可能據(jù)此確定生物分子在組織的不同部位的實(shí)際絕對(duì)含量。選擇組織圖像上的任意一個(gè)斑點(diǎn)，圖像都能夠給出一個(gè)質(zhì)譜譜圖或者離子譜圖，代表在組織的該部位存在這種生物分子，然后,與做指紋圖譜類似，像做指紋圖譜那樣，將樣品的離子譜圖與已知標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照，分析差異，從而進(jìn)行生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和藥物作用的監(jiān)控。

Ⅱ.無需樣品處理實(shí)時(shí)成像——電噴霧電離技術(shù)

一般質(zhì)譜成像方法由于體積龐大，重量重，需要冗長(zhǎng)的樣品準(zhǔn)備階段，因此，并不適用于即時(shí)成像（bed side applications），比如，要幫助外科醫(yī)生進(jìn)行實(shí)時(shí)的腫瘤邊界成像監(jiān)控，那么就要尋找新的方法了。

一種稱為電噴霧電離技術(shù)（desorption electrospray ionization，DESI）的MS成像技術(shù)解決了這個(gè)問題。DESI技術(shù)于2004年首次提出，由于這一方法具有樣品無需前處理就可以在常壓條件下，從各種載物表面直接分析固相或凝固相樣品等優(yōu)勢(shì)而得到了迅速的發(fā)展。

這種方法的原理是帶電液滴蒸發(fā)，液滴變小，液滴表面相斥的靜電荷密度增大。當(dāng)液滴蒸發(fā)到某一程度，液滴表面的庫侖斥力使液滴爆炸。產(chǎn)生的小帶電液滴繼續(xù)此過程。隨著液滴的水分子逐漸蒸發(fā)，就可獲得自由徘徊的質(zhì)子化和去質(zhì)子化的蛋白分子DESI與另外一種離子源：SIMS（二次離子質(zhì)譜）有些相似，只是前者能在大氣壓下游離化，發(fā)明這項(xiàng)技術(shù)的普渡大學(xué)Cooks博士認(rèn)為DESI方法其實(shí)就是一種抽取方法，即利用快速帶電可溶微粒（比如，水或者乙腈acetonitrile）進(jìn)行離子化，然后沖擊樣品，獲得分析物的方法。

DESI系列產(chǎn)品最大的優(yōu)勢(shì)就在于無需樣品處理，一般質(zhì)譜和高效液相色譜分析，樣品必須經(jīng)過特殊的分離流程才能夠進(jìn)行分析檢測(cè)，使得一次樣品檢測(cè)常常需要約一個(gè)小時(shí),而DESI系列產(chǎn)品可將固體樣品直接送入質(zhì)譜,溶液被噴射到檢測(cè)表面,促使樣品離子均勻分布。采用這一手段的質(zhì)譜分離過程，只需3分鐘左右即可完成。

Ⅲ.活體成像——APIR MALDI/LAESI技術(shù)

了解細(xì)胞的內(nèi)部成分是理解健康細(xì)胞不同于病變細(xì)胞的關(guān)鍵，但是，直到目前為止，唯一的方法是觀察單個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部，然后將其從動(dòng)物或植物中移除，或者改變細(xì)胞的生存環(huán)境。但是這么做的話，會(huì)使細(xì)胞發(fā)生變化�？茖W(xué)家還不是很清楚一個(gè)細(xì)胞在病變時(shí)與健康細(xì)胞的差別，或者當(dāng)它們從一個(gè)環(huán)境移到另一個(gè)環(huán)境中產(chǎn)生的變化。

來自華盛頓大學(xué)Akos Vertes教授希望能從另外一個(gè)方面來進(jìn)行活細(xì)胞分析，在他的一項(xiàng)關(guān)于活葉樣品中初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物分布的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)葉片中積累基質(zhì)很厚，常導(dǎo)致光譜末端低分子量部分模糊，而且基質(zhì)輔助激光解析電離（MALDI）質(zhì)譜分析需要在真空中進(jìn)行，但是，活體樣本在真空中無法存活。

實(shí)際上，MALDI質(zhì)譜分析的原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，由于，基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進(jìn)入氣相。而生物樣品也可以直接吸收能量的，比如，2.94mm波長(zhǎng)的光能激活水中氫氧鍵。

因此，Vertes等人想到復(fù)合兩種技術(shù)來解決這一問題。首先他們利用大氣壓紅外線（an atmosphericpressure infrared，APIR）MALDI激光直接激活組織中的水分，使樣品氣化，就像是組織表面發(fā)生了細(xì)胞大小的核爆炸，從而獲得了離子化微粒，進(jìn)入質(zhì)譜中進(jìn)行分析。但是并不是所有的氣化微粒都帶電，大部分其實(shí)是不帶電的，會(huì)被APIR MALDI遺漏。

為了捕捉這些中性粒子，Vertes等人采用了第二種方法：

LAESI(laser ablation electrospray ionization，激光燒蝕電噴霧電離)，這種方法能捕捉大量帶電微滴的微粒，然后重新電離化。通過對(duì)整個(gè)樣品進(jìn)行處理，復(fù)合這兩種方法，就能覆蓋更多的分子，分析質(zhì)量更高。

與一般質(zhì)譜成像過程不同，Verte的方法還在成像中增加了高度，從而實(shí)現(xiàn)了3D代謝物成像。這項(xiàng)技術(shù)的分辨率是直徑10mm，高度30mm，這與生物天然的立體像素相吻合，這樣科學(xué)家們就可以獲得天然構(gòu)像。

Ⅳ.3D成像——二次離子質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜成像技術(shù)能將基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜的離子掃描與圖像重建技術(shù)結(jié)合，直接分析生物組織切片，產(chǎn)生任意質(zhì)荷比(m/z)化合物的二維或三維分布圖。其中三維成像圖是由獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析處理軟件自動(dòng)標(biāo)峰，并生成該切片的全部峰值列表文件，然后成像軟件讀取峰值列表文件，給出每個(gè)質(zhì)荷比在全部質(zhì)譜圖中的命中次數(shù)，再根據(jù)峰值列表文件對(duì)應(yīng)的點(diǎn)陣坐標(biāo)繪出該峰的分布圖。

但是，一般的質(zhì)譜成像技術(shù)不能對(duì)一些攜帶大分子碎片的化學(xué)成分進(jìn)行成像，來自賓夕法尼亞州州立大學(xué)的NicholasWinograd教授改進(jìn)了一種稱為二次離子質(zhì)譜（SIMS，secondary ion mass spectrometry）的方法，可以對(duì)樣品進(jìn)行完整掃描，三維成像。

SIMS早在用于生物學(xué)研究之前就已經(jīng)應(yīng)用廣泛了，比如，分析集成電路（integratedcircuits）中的化學(xué)成分，這種質(zhì)譜技術(shù)是表面分析的有利工具，能檢測(cè)出微小區(qū)域內(nèi)的微量成分，具有能進(jìn)行雜質(zhì)深度剖析和各種元素在微區(qū)范圍內(nèi)同位素豐度比的測(cè)量能力。

這種技術(shù)具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

速度快（－10,000 spectra per second），亞細(xì)胞構(gòu)造分辨率（－100nm），以及不需要基質(zhì)。但是另外一方面，不同于MALDI方法，SIMS方面不是一種“軟”技術(shù)，這種方法只能對(duì)小分子成像，因此常常需要進(jìn)行粉碎。

Winograd教授改進(jìn)了這一方法，他利用了一種新型SIMS光束（carbon-60磁性球），這種新光束比傳統(tǒng)的SIMS光束對(duì)物體的化學(xué)損傷更小。C60同時(shí)撞擊樣品表面，類似于“一陣爆炸”，這樣重復(fù)的轟擊使得研究人員能深入樣品，進(jìn)行三維分子成像，Winograd教授稱這個(gè)過程是“分子深度成像”（molecular depth profiling）。

C60的能量與其它的離子束相當(dāng)，卻不到達(dá)樣品表面以下，這樣樣品可以連續(xù)地被逐層剝離，研究人員就可以得到縱面圖形，最終獲得三維的分子影像。Winograd教授等人用含有肽的糖溶液將硅的薄片包裹起來并進(jìn)行SIMS實(shí)驗(yàn)，隨著薄膜逐漸被C60剝蝕，可以獲得糖和肽的穩(wěn)態(tài)信號(hào)。最終，薄膜完全剝離后就可以獲得硅的信號(hào)。如果用其它的射線或原子離子代替C60，粒子束會(huì)快速穿過肽膜而無法提供有關(guān)生物分子的信息。因此，這種方法具有良好的空間分辨率，能夠獲得巨噬細(xì)胞和星型細(xì)胞的細(xì)胞特征和分析物的分布情況。

這里還要說到一點(diǎn)，SIMS和上一技術(shù)（APIR MALDI/LAESI技術(shù)）都可以對(duì)三維成像，但兩者也有差別，SIMS方法中，采用高能離子轟擊樣品，逐出分析物離子（二級(jí)離子），離子再進(jìn)入質(zhì)量分析器。MALDI方法則用激光輻射樣品使之離子化，另外SIMS探針可以探測(cè)到100nm的深度，能提供納米級(jí)的分辨率，而MALDI可以探測(cè)更深，但空間分辨率較低。

Ⅴ.高靈敏度高分辨率——納米結(jié)構(gòu)啟動(dòng)質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜在檢測(cè)生物分子方面有很大潛力，但現(xiàn)有方法仍存在一些缺陷，靈敏度不夠高和需要基質(zhì)分子促使分析對(duì)象發(fā)生離子化就是其中之二。比如說，需要溶解或者固定在基質(zhì)上的方法檢測(cè)代謝物，較易錯(cuò)判，因?yàn)檫@些代謝物與那些基質(zhì)常�？瓷先ザ家粯�。另外基于固定物基質(zhì)的系統(tǒng)也不允許研究人員精確的判斷出樣品中某一分子到底來自于哪兒。

來自斯克利普斯研究院的Gary Siuzdak博士發(fā)明了一種稱為納米結(jié)構(gòu)啟動(dòng)質(zhì)譜（nanostructure-initiator mass spectrometry，NIMS）的新技術(shù)，這種技術(shù)能以極高的靈敏度分析非常小的區(qū)域，從而允許對(duì)肽陣列、血液、尿和單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析，而且還能用于組織成像。

NIMS利用了一種特制的表面，這種多孔硅表面上聚集了一種含氟聚合物，這些分子在受到激光或離子束照射時(shí)會(huì)猛烈爆發(fā)，這種爆發(fā)釋放出離子化的分析物分子，它們被吸收到表面上，使其能夠被檢測(cè)到。這種方法利用激光或離子束來從納米尺度的小囊中氣化材料，從而克服了一般質(zhì)譜方法缺少所需的靈敏度和需要基質(zhì)分子促使分析對(duì)象發(fā)生離子化的缺陷。

通過這種方法可以分析很多類型的小分子，比如，脂質(zhì)，糖類，以及類固醇，雖然每一種分析材料需要的含氟聚合物有少許差別，但是這是一種一步法的方法，比MALDI簡(jiǎn)單多了——后者需要固定組織，并添加基質(zhì)。

由于，含氟聚合物不能很好的離子化，因此，會(huì)發(fā)生輕微的光譜干擾，而且由于離子化過程是“軟性”的——就像MALDI，所以NIMS產(chǎn)生的生物分子是整塊離子化，而不是片段離子化。不過這種技術(shù)對(duì)于完整蛋白的檢測(cè)靈敏度沒有MALDI高。