近年來,芯片介電電泳研究已從最初對生化樣品的簡單富集操作,擴(kuò)展到對納米材料、金屬顆粒等物質(zhì)的富集、分離和操控等[1~3]諸多方面。將介電電泳技術(shù)與流體力[4]、電場力[5]、激光鑷子[6]等模式結(jié)合也成為研究的新方向,而芯片介電電泳分析系統(tǒng)中的微電極結(jié)構(gòu)是決定分析效能的關(guān)鍵因素之一。因此,設(shè)計(jì)出分離性能更高、結(jié)構(gòu)更合理的微電極一直是人們關(guān)注的重點(diǎn),目前,介電電泳電極構(gòu)型已由過去傳統(tǒng)的平面式電極向三維式電極發(fā)展,出現(xiàn)了夾板式電極、籠式電極和絕緣柱式電極等[7,8]多種構(gòu)型。相比于常規(guī)電泳分析生化樣品時(shí)必須對樣品對象進(jìn)行復(fù)雜預(yù)處理或前衍生的缺陷,芯片介電電泳技術(shù)可依據(jù)樣品本身介電性質(zhì),在不進(jìn)行預(yù)處理的情況下直接對樣品進(jìn)行DEP富集操控,從而最大限度保持了樣品的生理活性;同時(shí)介電電泳芯片采用MEMS技術(shù)加工制作,整個(gè)操作過程都易于調(diào)控和實(shí)現(xiàn)集成化、自動化;芯片DEP過程中大多采用低壓高頻交流信號源,易于實(shí)現(xiàn)與其它分析方法的聯(lián)用。芯片介電電泳由于具有以上特點(diǎn)使其在生化樣品分析方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。

     介電電泳芯片分析系統(tǒng)通常由樣品進(jìn)樣和DEP驅(qū)動單元、樣品富集和分離單元以及檢測單元3部分構(gòu)成。樣品富集和分離過程在具有微電極或絕緣體結(jié)構(gòu)的介電電泳芯片上實(shí)現(xiàn)。樣品進(jìn)樣是通過在介電電泳芯片微通道兩端施加DEP直流信號或注射微泵驅(qū)使溶液流動來完成的。由交流信號激發(fā)的介電電泳稱為交流式介電電泳(AC-DEP),交流信號連接在芯片微電極上用以激發(fā)分析對象極化,實(shí)現(xiàn)DEP富集分離樣品的目的;直流信號激發(fā)的介電電泳稱為直流式介電電泳(DC-DEP),直流信號直接加在芯片微管道兩端,利用微管道內(nèi)的絕緣體使管道內(nèi)的電力線發(fā)生扭曲,產(chǎn)生非均勻電場實(shí)現(xiàn)樣品的DEP富集操控。

DEP芯片的微電極構(gòu)型是決定樣品富集位置的重要因素。常規(guī)介電電泳芯片的電極構(gòu)型包括堡式電極、拋物線式電極、叉指式電極和圓點(diǎn)式陣列電極等。目前,三維式電極結(jié)構(gòu)由于其富集操控手段的靈活性和電極設(shè)計(jì)和制作形式的多樣性,也是目前研究的熱點(diǎn)。AC-DEP模式是最初人們研究介電電泳現(xiàn)象時(shí)采用的DEP信號驅(qū)動模式,進(jìn)入本世紀(jì)后,人們開始探索DC-DEP和可實(shí)現(xiàn)樣品連續(xù)富集分離的流動式分離模式。

     介電電泳分析中最普遍的檢測手段仍是CCD顯微成像或熒光顯色CCD顯微成像技術(shù),通過顯微鏡觀測分析對象在介電電泳力代寫論文下的富集分離情況獲取分析信息。除了常規(guī)的CCD顯微成像檢測手段,將電化學(xué)檢測手段與芯片DEP模式耦合,是現(xiàn)今DEP檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢[9]。

     利用芯片介電電泳進(jìn)行生物樣品的富集和分離時(shí),樣品可在DEP作用下根據(jù)自身物理性質(zhì)的差異富集在DEP芯片的不同位置。單純依靠DEP作為分離富集驅(qū)動力時(shí),只能實(shí)現(xiàn)微粒的靜態(tài)原位富集和分離,將這種模式稱為靜態(tài)原位富集模式。當(dāng)介電電泳力與其它分離方法結(jié)合時(shí)實(shí)現(xiàn)的連續(xù)動態(tài)富集分離過程,稱為動態(tài)富集分離模式。

     DEP靜態(tài)原位富集模式是介電電泳研究中最早采用的模式,這時(shí)樣品富集位置主要取決于DEP芯片中微電極構(gòu)型的變化,不同的微電極結(jié)構(gòu)所對應(yīng)的正負(fù)DEP富集位置不同,樣品依據(jù)自身介電性質(zhì)差異受不同類型DEP作用,富集于芯片的不同位置。

Xu等[10]在帶有堡式電極的介電電泳芯片上觀測到了紅細(xì)胞的介電電泳現(xiàn)象。Ramadan等[11]在堡式電極結(jié)構(gòu)上實(shí)現(xiàn)了白血球(WBS)、小鼠無性細(xì)胞(MN9D)和酵母菌的介電電泳富集,并利用電穿孔技術(shù)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的電溶解(圖1),其管道內(nèi)溶液流速與細(xì)胞融膜率成反比。Arnold等[12]制作了一種可以捕獲和培育細(xì)胞的具有類堡式電極結(jié)構(gòu)的DEP芯片,通過控制交流信號使酵母菌在負(fù)介電電泳(nDEP)和重力作用下懸浮在分離通道內(nèi),降低交流信號頻率,使酵母菌沉降以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞富集,并在片上進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),實(shí)現(xiàn)了一系列的細(xì)菌懸浮、富集和片上培養(yǎng)操作。

     Li等[13]應(yīng)用平行陣列電極實(shí)現(xiàn)了微芯片上死活李斯特菌的原位分離富集,并通過對細(xì)菌熒光染色后區(qū)分其活性,再進(jìn)行熒光顯微成像檢測。Zhou等[14]設(shè)計(jì)了一種可以產(chǎn)生交流電滲擴(kuò)增的介電電泳芯片,芯片電極為三維構(gòu)型,底面采用陣列電極結(jié)構(gòu),頂面電極為覆蓋整個(gè)微管道的面電極,在這種裝置上實(shí)現(xiàn)了膠體微粒/酵母菌、紅細(xì)胞/酵母菌混合樣品體系的原位富集分離,并對這種情況下樣品所受的重Fig. 1　Image of enrichment and lysis process steps of WBC[11]

     圖2  拋物線式電極結(jié)構(gòu)上溶壁微球菌和大腸桿菌混合樣品的分離[15]Fig. 2  Separation of M.lysodeikticusand E.colion the microchip witha quadrupole electrode[15]力、DEP力和交流電滲力做了理論探討。Pethig[15]在拋物線式電極上實(shí)現(xiàn)了酵母菌的正介電電泳(pDEP)和負(fù)介電電泳(nDEP)富集,以及溶壁微球菌和大腸桿菌混合樣品的分離,并利用這一裝置研究了樣品的生理特性。圖2為溶壁微球菌和大腸桿菌在該裝置上的分離圖像。Abidin等[16]制作了一種可產(chǎn)生高梯度電場的DEP分離(HGES)系統(tǒng),這種DEP分離裝置由兩個(gè)同心圓柱構(gòu)成,圓柱與交流信號源接通,圓柱中間填充玻璃微珠用以產(chǎn)生高梯度的非均勻電場,以釀酒酵母為樣品討論了這種裝置的捕獲效率,并討論了同心電極尺寸和玻璃微珠直徑對細(xì)菌捕獲效率的影響。

     Ho等[17]設(shè)計(jì)了一種同心星狀電極結(jié)構(gòu)的DEP芯片,一系列的同心圓電極結(jié)構(gòu)擴(kuò)增了DEP信號,有效增強(qiáng)了系統(tǒng)的DEP富集效率。利用這一裝置富集肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,并采用熒光染色方式進(jìn)行后續(xù)檢測,裝置結(jié)構(gòu)圖和實(shí)驗(yàn)圖像如圖3所示。

圖3  同心星狀電極DEP芯片[17]Fig. 3　On-chip heterogeneous-cells patterning demonstration[17]在DEP分離中,樣品除了受DEP力作用外,在電極附近還會受到電滲流作用使樣品發(fā)生擾動,通常情況下,分析體系中的電極和樣品都是μm尺度的,電滲流對DEP作用的負(fù)面影響往往可以忽略不計(jì),但當(dāng)樣品微粒小至nm尺度時(shí),這一影響就不容忽視。為了消除電滲流對納米微粒富集的影響, Luo等[18]制作了一種電極寬度在nm級的DEP芯片,實(shí)現(xiàn)了納米級聚苯乙烯微粒和牛血清白蛋白(BSA)的DEP富集。

2·2　芯片介電電泳的分離富集模式單純依靠常規(guī)的電極構(gòu)型產(chǎn)生DEP力對樣品進(jìn)行介電富集和分離時(shí),很難實(shí)現(xiàn)樣品的連續(xù)分離和快速檢測。因此,設(shè)計(jì)出結(jié)構(gòu)合理、利于實(shí)現(xiàn)連續(xù)測定的電極構(gòu)型或者將其它分離技術(shù)與芯片介電電泳技術(shù)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)樣品的連續(xù)富集分離和操控是近年來芯片介電電泳研究的熱點(diǎn)。2·2·1　DEP與流體力偶合分離　程京等[19]采用棋盤式陣列電極(5×5)將DEP力和流體力結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了外周血細(xì)胞(Blood細(xì)胞)中宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)的連續(xù)富集和分離。實(shí)驗(yàn)采用Tris-硼酸緩沖液,分離條件為6V、30kHz,緩沖液流速控制在200μL/min,此時(shí)HeLa細(xì)胞受pDEP作用被富集在電極表面,而Blood細(xì)胞受nDEP作用富集在電極之間,之后利用流體力將Blood細(xì)胞沖入廢液池,而Hela細(xì)胞仍富集在電極表面,利用熒光染料對富集在電極表面的HeLa細(xì)胞染色后,進(jìn)行顯微成像檢測。Doh等[20]設(shè)計(jì)了一種可實(shí)現(xiàn)樣品連續(xù)富集分離的微流控DEP芯片(圖4),細(xì)胞混合樣品注入具有三電極結(jié)構(gòu)的微管道內(nèi),受pDEP作用的樣品偏離管道中心向管道兩邊富集而從出口1流出,受nDEP作用的細(xì)胞運(yùn)動方向不變從出口2流出,由此實(shí)現(xiàn)死活酵母菌的連續(xù)流動分離。結(jié)果表明,細(xì)菌分離效圖4　連續(xù)介電電泳DEP分離過程示意圖[20]

     Fig. 4　Scheme of hydrodynamic dielectrophoresis (DEP)process[20]率與溶液流速成反比。Suehiro等[21]將抗體固定到叉指電極式DEP芯片表面,利用pDEP力將混合樣品富集到芯片表面,利用抗原和抗體的特異性吸附作用,使靶細(xì)胞與固定在芯片表面的抗體結(jié)合,再利用液流將非靶細(xì)胞沖走,實(shí)現(xiàn)了兩種特定細(xì)胞的流動式介電富集和分離過程。Yang等[22]將該方法用于李斯特菌的介電誘捕免疫富集。Voldman等[23]在傳統(tǒng)叉指電極式DEP芯片的基礎(chǔ)上,在分離通道頂部采用SU-8制作了一系列無序攪拌凹槽,使溶液形成湍流,增加樣品與電極的接觸幾率,利用pDEP作用將樣品富集于電極表面。該設(shè)計(jì)中攪拌凹槽的引入間接提高DEP富集效率,可以明顯提高聚苯乙烯微珠和B.subtilis孢子的富集效果。

     Li等[24]設(shè)計(jì)了一種將進(jìn)樣、餾分和樣品收集三個(gè)單元集成在一起的芯片。在進(jìn)樣區(qū)域,通過液鞘的夾流作用控制樣品寬度,餾分單元部分管道底部布有平行電極(電極寬度和間距均為10μm)用以產(chǎn)生非均勻電場,完成細(xì)胞樣品的分離和篩選,最后,經(jīng)過分離篩選的細(xì)胞樣品從兩個(gè)出液口排出而被收集。他們對該芯片進(jìn)樣區(qū)域的微流控過程進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬,并采用酵母菌為模板樣本對裝置的分離效果進(jìn)行了驗(yàn)證。Cummings等[25]提出了絕緣式介電電泳(iDEP)的概念。在常規(guī)的十字芯片內(nèi)刻蝕一系列絕緣體柱,將直流電信號施加在芯片微管道兩端,通過管道內(nèi)的絕緣體柱擾動電力線以形成非均勻電場。他們對DC-DEP模式的理論分析和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在此模式下微粒會經(jīng)歷流動式介電電泳(streaming-DEP)和誘捕式介電電泳(trapping-DEP)2種狀態(tài);不同絕緣體形狀(圓形陣列電極、菱形陣列電極)、絕緣體直徑以及絕緣體間夾角變化對通道內(nèi)電場強(qiáng)度梯度分布也有影響。他們對活性大腸桿菌(E.coli)和失活的E.coli的混合樣品進(jìn)行了連續(xù)富集和分離[26];實(shí)現(xiàn)了污水[27]中E.coli、革蘭氏陽性細(xì)菌枯草芽孢桿菌(B.subtilis spores)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)的兩兩富集分離;富集了革蘭氏陽性細(xì)菌枯草芽孢桿菌(B.subtilis spores)、煙草花葉病病毒(TMV)和E.coli單樣品[8],其中E.coli的富集效率接近100%。他們的研究引起了分析工作者對DC-DEP分析模式的濃厚興趣。Kang等[28]設(shè)計(jì)了另一種結(jié)構(gòu)的DC-DEP芯片,利用分離通道中絕緣的聚苯乙烯鏈段,使電力線發(fā)生扭曲,產(chǎn)生非均勻電場,聚苯乙烯微球在介電電泳力和流體力的共同作用下依據(jù)微粒尺寸得到分離(如圖5所示)。Barbulovic-Nad等[29]采用油滴作為絕緣體,通過控制油滴的尺寸間接調(diào)整DEP力實(shí)現(xiàn)了不同尺寸介電微粒的連續(xù)分離。

     圖5　絕緣電極式DEP芯片分離直徑為5·7和15·7mm的聚苯乙烯微粒[28]Fig. 5　Separation of 5·7 and 15·7 mm particles by applied voltages on different electrodes at 500 V voltage level[28]2·2·2　DEP與激光鑷子耦合分離　1998年Morishima等[30]將激光鑷子技術(shù)與DEP技術(shù)結(jié)合,芯片采用拋物線式電極結(jié)構(gòu),通過nDEP使大腸桿菌富集,同時(shí)激光鑷子將單個(gè)樣品移動到監(jiān)測點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞樣品的單個(gè)檢測和操控。Arai等[31]在這兩種方法耦合的基礎(chǔ)上引入流體力,將單個(gè)酵母菌樣品從分析區(qū)域轉(zhuǎn)移出微通道(圖6)。介電電泳與激光鑷子技術(shù)聯(lián)用,不能實(shí)現(xiàn)大量樣品的高效快速富集分離操作,但卻可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)樣品的精確操控,這為臨床上獲得純度為100%的生物樣品提供圖6　細(xì)胞操控過程示意圖[31]Fig. 6　Transportion trajectory ofthe target cell[31]了可能。

2·2·3　其它耦合模式的分離　Cui等[32]設(shè)計(jì)了一種行波介電電泳(twDEP)DEP芯片,其具有一系列平行陣列電極,通過在其上施加相差為90°的交流信號可實(shí)現(xiàn)樣品twDEP驅(qū)動,將樣品進(jìn)行pDEP富集于twDEP電極的初始位置,再對樣品進(jìn)行twDEP操控(圖7),實(shí)現(xiàn)了乳膠微粒和小鼠心肌細(xì)胞的電懸浮和連續(xù)流動操控。

　　Taff等[33]給出一種可以設(shè)置細(xì)胞富集位置的pDEP細(xì)胞篩分陣列的芯片設(shè)計(jì),采用同心圓式雙層陣列電極,通過對陣列電極的定位控制,實(shí)現(xiàn)了單個(gè)人類血癌細(xì)胞的誘捕、操控和釋放。Cheung等[34]設(shè)計(jì)了夾板式和籠式電極結(jié)合的介電電泳芯片(圖8),在359kHz~20MHz范圍內(nèi),采用阻抗檢測對經(jīng)過不同處理的紅細(xì)胞進(jìn)行分離和阻抗分析,分析速度達(dá)到1000個(gè)/min。Yasukawa等[35]提出一種能夠用于免疫分析的介電電泳芯片。該芯片采用三維電極結(jié)構(gòu),能夠在芯片微管道內(nèi)形成介電籠,將作為固相載體的聚苯乙烯固定在芯片管道中,實(shí)現(xiàn)了流動體系中抗原與抗體的完全反應(yīng),此系統(tǒng)能夠在40min內(nèi)完成對小鼠IgG的免疫分析。