通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

[實(shí)驗(yàn)原理]

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。在待擴(kuò)增的DNA片段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。

1．變性：加熱 使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。

2．退火：使溶液溫度降至50-60℃，模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)全，即退火階段。

3．延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5’→3’方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA，即引物的延伸階段。

上述3步為一個(gè)循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個(gè)階段。從理論上講，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25-30個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106-109倍。

典型的RCP反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖、dNTP、MgCl2、兩個(gè)合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶。

[實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備]

1．PCR基因擴(kuò)增儀

2．瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)

[實(shí)驗(yàn)材料]

1. DNA模板 2. 4種dNTP

3. 引物1和引物2 4. Taq酶

5. 瓊脂糖 6. DNA Marker

7. tip 8.eppendorf管

9. 微量移液器

附試劑的配制：

1. 10×PCR緩沖液

500mmol/L KCl

100mmol/L Tris·HCl(Ph8.3,室溫)

15mmol/L MgCl2

0.1% 明膠

2. 4×dNTP

10mmol/L dATP

10mmol/L dCTP

10mmol/L dGTP

10mmol/L dTTP

3. Taq酶 1u/μL

4. DNA模板 1ng/μL

5. 引物溶液濃度 10pmol/μL

[實(shí)驗(yàn)步驟]

1．在0.5ml Eppendorf管內(nèi)配制25μL反應(yīng)體系

反應(yīng)物 體積/μL

ddH2O 11

10×PCR緩沖液 2.5

2.5mmol/L dNTP 2.0

25mmol/L MgCl2 1.5

引物1 1.0

引物2 1.0

模板DNA 5

Taq酶 1

混勻,加25μL石蠟油.

2.按下述程序進(jìn)行擴(kuò)增

① 94℃預(yù)變性 5min

② 94℃變性 1min

③ 52℃退火 1min

④ 72℃延伸 1min

⑤ 重復(fù)步驟②-④35次

⑥ 72℃終延伸 10min

3．瓊脂糖凝膠電泳分析RCR結(jié)果

配制1.5%瓊脂糖凝膠，取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳。保持電流40mA.電泳結(jié)束后，用EB染色15min,紫外燈下觀察結(jié)果。

[作業(yè)]

根據(jù)紫外燈下觀察的結(jié)果，畫出電泳示意圖，并討論P(yáng)CR反應(yīng)應(yīng)注意的事項(xiàng)。

[實(shí)驗(yàn)安排]

6學(xué)時(shí)

1天內(nèi)可完成，上午做PCR反應(yīng)，下午做電泳檢測。