將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、特異性高，非特異性熒光染色少，相對(duì)使用標(biāo)記抗體用量偏大。

試劑與儀器

磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)：0.01mol/L，pH7.4

熒光標(biāo)記的抗體溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 進(jìn)行稀釋

緩沖甘油：分析純無(wú)熒光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液 1 份配制

搪瓷桶三只(內(nèi)有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml)

有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|)

熒光顯微鏡

玻片架

濾紙

37℃溫箱等。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。

2. 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一

30min

定時(shí)間(參考：30min)。

3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 沖洗后，再按順序過(guò) 0.01mol/L，

pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不時(shí)振蕩。

4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。

5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“+”表示：

(-)無(wú)熒光；(±)極弱的可疑熒光；(+)熒光較弱，但清楚可見(jiàn)；(++)熒光明亮；(+++

--++++)熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上，而各種對(duì)照顯示為(±)

或(-)，即可判定為陽(yáng)性。

 

注意事項(xiàng)

1. 對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋在 1：20-100 之

間，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀釋比例，抗體濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過(guò)弱，

影響結(jié)果的觀察。

2. 染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從 10 min 到數(shù)

小時(shí)，一般 30 min 已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右)，高于 37℃可加強(qiáng)染色效果，

但對(duì)不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用 0-2℃的低溫，延長(zhǎng)染色時(shí)間。低溫染

色過(guò)夜較 37℃30 min 效果好的多。

3. 為了保證熒光染色的正確性，首次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照，以排除某些非特異性熒光染

色的干擾。

(1)標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加 1-2 滴 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS。

(2)特異性對(duì)照(抑制試驗(yàn))：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗

體。

如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光， 待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽(yáng)性染色。

4. 一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò) 3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。