掌握動(dòng)物骨髓染色體標(biāo)本制備基本過(guò)程，了解操作步驟的原理

 

實(shí)驗(yàn)原理

小鼠骨髓細(xì)胞中的造血干細(xì)胞是生成各種血細(xì)胞和原始細(xì)胞，具有高度的分裂能力，本實(shí)驗(yàn)采用這一材料，通過(guò)前處理，低滲，固定，制片，染色等步驟制得染色體標(biāo)本，可觀察到許多處于分裂中期的染色體，可以進(jìn)行染色體組型分析。

實(shí)驗(yàn)原理

制備方法包括以下幾個(gè)要點(diǎn): 

1. 用一定劑量的秋水仙素破壞紡錘絲的形成，使細(xì)胞分裂停滯在中期, 使中期染色體停留在赤道面處

2. 用低滲法使將細(xì)胞膨脹, 以至于在滴片時(shí)細(xì)胞被脹破, 使細(xì)胞的染色體鋪展到載玻片上

3. 空氣干燥法可使使細(xì)胞的染色體在載片上展平, 經(jīng)Giemsa染色后便可觀察到染色體的顯微圖象 

 

 實(shí)驗(yàn)用品

1．材料：小白鼠 

2．器具：注射器（1ml,5ml） 剪刀 鑷子 玻璃吸管 10ml刻度的離心管 離心機(jī) 載玻片 蓋玻片 顯微鏡 濾紙 擦鏡紙 紗布 恒溫水浴鍋 

3．藥品：0.01%秋水仙素 0.075MKCl 固定液（甲醇：冰醋酸=3：1） 2%檸檬酸鈉 改良石炭酸品紅

實(shí)驗(yàn)步驟

預(yù)處理→取股骨→沖洗骨髓→離心→低滲→離心→固定→離心→滴片→染色→觀察 

 

1．預(yù)處理：實(shí)驗(yàn)前2.5-3小時(shí)，按每克體重注射0.02ml，給小白鼠腹腔注射秋水仙素。 

2．取股骨：斷頸處死小鼠后，剔去肌肉組織，洗凈

3．沖洗骨髓：剪去兩端的股骨頭，吸取 10ml 2%檸檬酸鈉，注射 器針頭插入股骨一端,反復(fù)沖洗兩根股骨，洗液收集到10ml的離心管中

4 ．離心： 1000r/min 離心10 min ,棄上清

5 ．低滲：加入8ml 0.075mol/LKCl溶液,滴管吹散,37℃水浴低滲30 min ，中間（約15 min ）再吹散一次，使細(xì)胞分散，懸浮于溶液中 

6．離心：1000r/min離心10 min，棄上清

7．固定：沉淀加8ml固定液，并用吸管輕 輕吹勻，進(jìn)行固定，中間（約15 min ）再吹散一次

 實(shí)驗(yàn)步驟

8. 離心： 1000r/min 離心10 min ,留1 ml 左右上清，輕輕吹打成細(xì)胞懸液

9. 滴片：用吸管吸取細(xì)胞懸液，高度30-40 cm，滴在預(yù)冷的載玻片上，在酒精燈火焰上微微加熱，室溫晾干 

10. 染色：改良石炭酸品紅染色10-20 min

11. 觀察：低倍———高倍