2. 0.7％瓊脂加熱融化后加入華氏管內(nèi)，每管2ml，47～49℃水浴保溫備用。

　　3. 免疫小鼠脾細胞懸液制備：用4×10３ 個綿羊紅細胞(SRBC)鹽水懸液腹腔免疫小鼠，對照為等量生理鹽水。4天后，小鼠拉脫頸椎處死，取出脾臟，用RPMI164。洗一次后置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上,用注射器針芯研磨成懸液,洗滌兩次,調(diào)整細胞數(shù)為3～8×10６/ml。臺盼蘭染色查活細胞數(shù)應(yīng)大于90％。置4℃冰箱備用。

　　4. 試驗平皿的制備：依次將預(yù)溫40℃左右的25％SRBC、牼-SRBC吸收的滅活胎牛血清以及保存于4℃的脾細胞懸液各0.1ml加入預(yù)熱47～49℃的含0.7％瓊脂的華氏管中，迅速混勻，立即傾注于鋪有底層瓊脂的平皿內(nèi)，凝固后，置37℃孵育1小時。

5. 加入1∶5～1∶10稀釋的新鮮豚鼠血清0.5～1.0ml，使其均勻覆蓋表面,再次置37℃溫育30分鐘，即可用肉眼或借助于放大鏡進行空斑計數(shù)。

　　三、試劑和器材 免疫學(xué)實驗技術(shù)論壇  http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html

　　㈠ 試劑

　　1. 1.4％瓊脂：用pH7.4PBS配制。

　　2. 0.7％瓊脂：用pH7.4PBS配制

3. 25％SRBC鹽水懸液

4. RPMI1640

5. 胎牛血清，56℃30分鐘滅活，并經(jīng)SRBC吸收

　　6. 補體：新鮮豚鼠血清，用前經(jīng)SRBC吸收后，用RPMI1640稀釋。

　�、� 器材：玻璃平皿7×1.5cm，三角燒瓶，水浴箱(47～49℃)，華氏管，1ml注射器，不銹鋼篩網(wǎng)，青霉素瓶，離心管，不同規(guī)格加樣器等。

四、注意事項：

　　1. 0.7％瓊脂必須置47～49℃水浴融態(tài)保溫。如溫度過高會導(dǎo)致SRBC溶血或所加入脾細胞的死亡。溫度過低則在操作過程中瓊脂發(fā)生凝固，影響上層瓊脂平板的制備

2. 離體的脾細胞應(yīng)置4℃冰箱保存，防止抗體分泌和細胞死亡。

　　3. 在制備試驗平皿時，對于所有玻璃器皿和各種試劑 ，均需預(yù)溫，牭1各種試劑加入華氏管后，應(yīng)與0.7％瓊脂 迅速充分混勻，然后立即傾倒于底層瓊脂 上，并避免傾入氣泡。

　　4. 加入的補體應(yīng)均勻覆蓋于表層瓊脂上。

　　5. 制備底層平皿和試驗平皿時，均須將平皿置于水平臺上，以保證瓊脂面鋪平。