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色譜分析的重要作用之一是對(duì)樣品定量。而色譜法定量的依據(jù)是：組分的重量或在載氣中的濃度與檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)成正比。常見定量分析方法分為面積歸一化法、內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法等。大家常常容易傻傻分不清楚的莫過于內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法了。
以內(nèi)標(biāo)法為例，選一與欲測(cè)組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標(biāo)物（當(dāng)然是樣品中沒有的組分），然后配制欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣得相對(duì)校正因子。再將內(nèi)標(biāo)物加入欲測(cè)組分的樣品中，進(jìn)樣后測(cè)得欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的定量參數(shù)，用內(nèi)標(biāo)法公式計(jì)算即可。
其實(shí)，從定義上來區(qū)分的話，外標(biāo)法就是用標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積或峰高與其對(duì)應(yīng)的濃度做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)出樣品的峰面積或峰高，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對(duì)應(yīng)的濃度，這是最常用的一種定量方法；內(nèi)標(biāo)法是對(duì)應(yīng)外標(biāo)法說的，內(nèi)標(biāo)法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物，加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中，根據(jù)被測(cè)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比，來計(jì)算被測(cè)組分的含量。
外標(biāo)法需要用樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，但是有時(shí)我們很難保證樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)的體積是一樣的，畢竟要有誤差，這時(shí)候就用內(nèi)標(biāo)法，就是在外標(biāo)法的基礎(chǔ)上，在樣品和標(biāo)準(zhǔn)品里在加入一種物質(zhì)，通過加入物質(zhì)的峰面積或峰高的變化，就可以看出我們標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)樣體積的差別，但同時(shí)會(huì)引進(jìn)加入物質(zhì)的秤量誤差。所以一般用外標(biāo)法來定量，如果進(jìn)樣體積很難掌握，就用內(nèi)標(biāo)法，可以消除進(jìn)樣體積的誤差。
首先用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。具體作法是：用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與欲測(cè)組分相同的色譜條件下，等體積準(zhǔn)確量進(jìn)樣，測(cè)量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對(duì)樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，此標(biāo)準(zhǔn)工作曲線應(yīng)是通過原點(diǎn)的直線。若標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過原點(diǎn)，說明測(cè)定方法存在系統(tǒng)誤差。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率即為絕對(duì)校正因子。
當(dāng)欲測(cè)組分含量變化不大，并已知這一組分的大概含量時(shí)，也可以不必繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，而用單點(diǎn)校正法，即直接比較法定量。單點(diǎn)校正法實(shí)際上是利用原點(diǎn)作為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上的另一個(gè)點(diǎn)。因此，當(dāng)方法存在系統(tǒng)誤差時(shí)（即標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過原點(diǎn)），單點(diǎn)校正法的誤差較大。因此規(guī)定，y=ax+b， b的絕對(duì)值應(yīng)不大于100%響應(yīng)值是y的2%。
標(biāo)準(zhǔn)曲線法的優(yōu)點(diǎn)：繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線后測(cè)定工作就很簡(jiǎn)單了，計(jì)算時(shí)可直接從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上讀出含量，這對(duì)大量樣品分析十分合適。特別是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制后可以使用一段時(shí)間，在此段時(shí)間內(nèi)可經(jīng)常用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行單點(diǎn)校正，以確定該標(biāo)準(zhǔn)工作曲線是否還可使用。
標(biāo)準(zhǔn)曲線法的缺點(diǎn)：每次樣品分析的色譜條件（檢測(cè)器的響應(yīng)性能，柱溫度，流動(dòng)相流速及組成，進(jìn)樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差。另外，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制時(shí)，一般使用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品（或已知準(zhǔn)確含量的樣品），因此對(duì)樣品前處理過程中欲測(cè)組分的變化無法進(jìn)行補(bǔ)償。
選擇適宜的物質(zhì)作為欲測(cè)組分的參比物，定量加到樣品中去，依據(jù)欲測(cè)組分和參比物在檢測(cè)器上的響應(yīng)值（峰面積或峰高）之比和參比物加入的量進(jìn)行定量分析的方法稱為內(nèi)標(biāo)法。
內(nèi)標(biāo)法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是原樣品中不存在的純物質(zhì)，該物質(zhì)的性質(zhì)應(yīng)盡可能與欲測(cè)組分相近，不與被測(cè)樣品起化學(xué)反應(yīng)，同時(shí)要能完全溶于被測(cè)樣品中。內(nèi)標(biāo)物的峰應(yīng)盡可能接近欲測(cè)組分的峰，或位于幾個(gè)欲測(cè)組分的峰中間，但必須與樣品中的所有峰不重疊，即完全分開。
內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣量的變化，色譜條件的微小變化對(duì)內(nèi)標(biāo)法定量結(jié)果的影響不大，特別是在樣品前處理（如濃縮、萃取，衍生化等）前加入內(nèi)標(biāo)物，然后再進(jìn)行前處理時(shí)，可部分補(bǔ)償欲測(cè)組分在樣品前處理時(shí)的損失。若要獲得很高精度的結(jié)果時(shí)，可以加入數(shù)種內(nèi)標(biāo)物，以提高定量分析的精度。
內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)：選擇合適的內(nèi)標(biāo)物比較困難，內(nèi)標(biāo)物的稱量要準(zhǔn)確，操作較麻煩。使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)要測(cè)量欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的兩個(gè)峰的峰面積（或峰高），根據(jù)誤差疊加原理，內(nèi)標(biāo)法定量的誤差中，由于峰面積測(cè)量引起的誤差是標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量的2-2是由于進(jìn)樣量的變化和色譜條件變化引起的誤差，內(nèi)標(biāo)法比標(biāo)準(zhǔn)曲線法要小很多，所以總的來說，內(nèi)標(biāo)法定量比標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量的準(zhǔn)確度和精密度都要好。
標(biāo)準(zhǔn)加入法實(shí)質(zhì)上是一種特殊的內(nèi)標(biāo)法，是在選擇不到合適的內(nèi)標(biāo)物時(shí)，以欲測(cè)組分的純物質(zhì)為內(nèi)標(biāo)物，加入到待測(cè)樣品中，然后在相同的色譜條件下，測(cè)定加入欲測(cè)組分純物質(zhì)前后欲測(cè)組分的峰面積（或峰高），從而計(jì)算欲測(cè)組分在樣品中的含量的方法。
標(biāo)準(zhǔn)加入法的優(yōu)點(diǎn)：不需要另外的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物，只需欲測(cè)組分的純物質(zhì)，進(jìn)樣量不必十分準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單。若在樣品的前處理之前就加入已知準(zhǔn)確量的欲測(cè)組分，則可以完全補(bǔ)償欲測(cè)組分在前處理過程中的損失，是色譜分析中較常用的定量分析方法。
標(biāo)準(zhǔn)加入法的缺點(diǎn)：要求加入欲測(cè)組分前后兩次色譜測(cè)定的色譜條件完全相同，以保證兩次測(cè)定時(shí)的校正因子完全相等，否則將引起分析測(cè)定的誤差。
選擇內(nèi)標(biāo)物有4個(gè)要求： 1、內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)； 2、它必須完全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離； 3、加入內(nèi)標(biāo)物的量應(yīng)接近于被測(cè)組分； 4、色譜峰的位置應(yīng)與被測(cè)組分的色譜峰的位置相近，或在幾個(gè)被測(cè)組分色譜峰中間。
內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確，由于通過測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及被測(cè)組分的峰面積的相對(duì)值來進(jìn)行計(jì)算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)是操作程序較為麻煩，每次分析時(shí)內(nèi)標(biāo)物和試樣都要準(zhǔn)確稱量，有時(shí)尋找合適的內(nèi)標(biāo)物也有困難。
外標(biāo)法簡(jiǎn)便，但進(jìn)樣量要求十分準(zhǔn)確，要嚴(yán)格控制在與標(biāo)準(zhǔn)物相同的操作條件下進(jìn)行，否則造成分析誤差，得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。
內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都是定量的一種方法而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不同的分析，面對(duì)著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問題，我想簡(jiǎn)單而有效進(jìn)行定量分析來滿足要求才是最重要的。
何時(shí)添加內(nèi)標(biāo)
下面用幾個(gè)例子來說明：案例1： 以前做過很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動(dòng)進(jìn)樣器，用外標(biāo)法定量，確實(shí)重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差，結(jié)果經(jīng)常受到搞合成同事的質(zhì)疑。其實(shí)，仔細(xì)分析原因不一定就是外標(biāo)法不適合這種定量分析，首先我們的實(shí)驗(yàn)室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當(dāng)（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對(duì)稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒有其它色譜峰的干擾、選用什么進(jìn)樣方式（如快速進(jìn)樣還是熱針進(jìn)樣）等等因素的影響都需要考慮，如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗(yàn)證對(duì)于精密度的要求，同一樣品進(jìn)6針以上的RSD和配制6個(gè)樣品的定量結(jié)果RSD都能滿足小于1.5%的要求，那么這個(gè)方法用外標(biāo)法就是完全適用的，但是前面的影響因素是一定要都考慮到的，否則談?wù)撨@個(gè)方法是否適用就有失偏頗了。
在做過的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當(dāng)中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗(yàn)證過的方法，內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都有（他們用的都是自動(dòng)進(jìn)樣）精密度都能滿足RSD小于1.5%的要求，當(dāng)一個(gè)方法能夠滿足測(cè)試要求的時(shí)候，無論內(nèi)標(biāo)外標(biāo)，都是可行的，當(dāng)然有一個(gè)分析成本和分析時(shí)間的問題，內(nèi)標(biāo)的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當(dāng)然要比外標(biāo)要高和麻煩一些了。而有些時(shí)候，可能受你實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影響，達(dá)不到一定的要求，而還必須進(jìn)行定量分析，有時(shí)外標(biāo)的結(jié)果可能就要差一些，這時(shí)，你可能就要考慮用內(nèi)標(biāo)法了，可以排除手動(dòng)進(jìn)樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時(shí)內(nèi)標(biāo)可能就顯示出它的優(yōu)勢(shì)來了。
案例2： 上面已經(jīng)提到當(dāng)做方法驗(yàn)證的時(shí)候，當(dāng)同一樣品配制6個(gè)樣品溶液用所選用的外標(biāo)法進(jìn)行定量的時(shí)候，RSD都滿足1.5%的要求時(shí)，也分為兩種情況，小于1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的結(jié)果小于1%，那這個(gè)方法就沒有什么可以懷疑的了；如果RSD的結(jié)果大于1%而在1.5%略低一些的范圍活動(dòng)時(shí)，這個(gè)方法的可行性就將受到質(zhì)疑，畢竟這是方法驗(yàn)證，你就要考慮上面1所提到的影響因素的影響了，如果排除掉以上的影響因素，RSD還是在1.5%附近，就要嘗試內(nèi)標(biāo)了，如果內(nèi)標(biāo)結(jié)果的RSD很好，就證明你的這個(gè)方法受實(shí)驗(yàn)條件的影響很大，只能用內(nèi)標(biāo)了，或者干脆將原方法做大的變動(dòng)，再嘗試用外標(biāo)法測(cè)試。
案例3： 而對(duì)于微量分析，比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等，根據(jù)不同的限量標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多，RSD有時(shí)可以允許達(dá)到10%甚至更高，這時(shí)可能外標(biāo)法有更大的應(yīng)用空間。
案例4： 單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，個(gè)人認(rèn)為還是內(nèi)標(biāo)優(yōu)于外標(biāo)。曾經(jīng)做過一個(gè)中間體二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺為內(nèi)標(biāo)，RTX-5amine（堿改性）15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析，將配制好的控制溶液（含有內(nèi)標(biāo)物）自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)6針，目的物（二氨基丙醇）與內(nèi)標(biāo)物（二乙醇胺）峰面積比率的RSD為0.18%，而只對(duì)這六針樣品的目的物峰（二氨基丙醇）面積求RSD，結(jié)果為0.71%，通過這一實(shí)例的結(jié)果大家就會(huì)發(fā)現(xiàn)到底哪個(gè)方法精密度更好了，當(dāng)然是內(nèi)標(biāo)更好了。當(dāng)然這個(gè)化合物的檢測(cè)方法最后根據(jù)上面的驗(yàn)證數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)定量都是可以的，實(shí)驗(yàn)室可以自由選擇。但內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)精密度結(jié)果的差異是顯然存在的事實(shí)。
綜上所述，如果應(yīng)用外標(biāo)法能夠滿足要求的話，當(dāng)然首選還是外標(biāo)法，畢竟簡(jiǎn)單而省事。對(duì)于精密度要求比較高、結(jié)果準(zhǔn)確度會(huì)產(chǎn)生重大影響、實(shí)驗(yàn)室條件不是很理想的等等條件下，用內(nèi)標(biāo)法還是必要的。但無論應(yīng)用那種方法，方法的驗(yàn)證和確認(rèn)都是很重要的，只要是按照程序經(jīng)過驗(yàn)證和確認(rèn)的方法，都有其應(yīng)用的空間的。個(gè)人觀點(diǎn)，供大家參考。
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外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法、直接比較法）
內(nèi)標(biāo)法
標(biāo)準(zhǔn)加入法
在許多應(yīng)用中，內(nèi)標(biāo)應(yīng)盡可能早地添加到分析過程中，例如用于校正樣品制備過程中的損失。但在某些應(yīng)用中，可能需要在稍后階段添加內(nèi)標(biāo)。例如，對(duì)于有消解階段的方法，如果所選的內(nèi)標(biāo)是消解后目標(biāo)化合物的類似物，那么在消解階段之后添加可能是最合適的。選擇非同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面：
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任何要分析的樣品中都不應(yīng)該含有這種物質(zhì)。例如，使用處方藥作為治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM) 應(yīng)用的內(nèi)標(biāo)就不是一個(gè)好主意。
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內(nèi)標(biāo)物的理化性質(zhì)應(yīng)盡可能與目標(biāo)分析物相似，洗脫時(shí)間應(yīng)盡可能接近目標(biāo)分析物。
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同分異構(gòu)體、同源物和結(jié)構(gòu)類似物通常是理想的候選物質(zhì)。
▲ 圖1. 內(nèi)標(biāo)使用示意圖【來源：Probing Protein Glycation by Chromatography and Mass Spectrometry: Analysis of Glycation Adducts】
同位素內(nèi)標(biāo)的使用
如果有同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)，則應(yīng)在分析開始時(shí)添加，以用于計(jì)算一些方法變量，包括：
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轉(zhuǎn)移和凈化階段的損失。
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提取效率的變化。
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進(jìn)樣量的變化。
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基質(zhì)抑制/增強(qiáng)。
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樣品和校準(zhǔn)品之間響應(yīng)的變化
在使用同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)時(shí)需要謹(jǐn)慎。如果有多種同位素可供選擇，在 LC-MS 應(yīng)用中，13C 和 15N 標(biāo)記的化合物通常比氘（2H）標(biāo)記的化合物更受歡迎。這是因?yàn)榕c 13C 和 15N 內(nèi)標(biāo)相比，氘標(biāo)記化合物的色譜保留時(shí)間與天然化合物的色譜保留時(shí)間有較大偏移。在液相色譜應(yīng)用中，與高效氣相色譜分離相比，這種保留時(shí)間的偏移通常很小，但目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)在基質(zhì)抑制（和增強(qiáng)）方面仍有可能存在細(xì)微差別，進(jìn)而影響測(cè)量的峰面積。
在選擇同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)時(shí)，還應(yīng)考慮以下幾點(diǎn)：
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標(biāo)記應(yīng)在分子的穩(wěn)定部分，標(biāo)記程度不應(yīng)因分析過程中發(fā)生的反向交換而改變�？赡軙�(huì)發(fā)生意想不到的交換，例如通過同分異構(gòu)機(jī)制發(fā)生的交換，因此在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)始終對(duì)這方面進(jìn)行檢查。
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目標(biāo)分析物和內(nèi)標(biāo)之間不應(yīng)有任何明顯的質(zhì)譜重疊。因此，在大多數(shù)小分子應(yīng)用中，內(nèi)標(biāo)的單同位素質(zhì)量最好至少比天然化合物高 3 Da。
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在 IDMS 方法中，內(nèi)標(biāo)和目標(biāo)物的完全平衡對(duì)確保準(zhǔn)確性至關(guān)重要�？赡苄枰M(jìn)行平衡和萃取研究，以證明目標(biāo)物已被完全萃取/釋放而未發(fā)生降解，或者內(nèi)標(biāo)已與樣品平衡，并與基質(zhì)成分和/或活性表面結(jié)合到與目標(biāo)物相同的程度。
若在儀器上使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，則橫坐標(biāo)為：目標(biāo)物濃度與內(nèi)標(biāo)濃度的比值；縱坐標(biāo)為目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（外標(biāo)法的橫坐標(biāo)為目標(biāo)物濃度，縱坐標(biāo)為目標(biāo)物峰面積）。
下面用幾個(gè)例子來說明：
小結(jié)
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