1. 原理：1mL水樣在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上、在有氧條件下36℃±1℃培養(yǎng)48h后，所得1mL水樣中的菌落總數(shù)的方法。

2. 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

   成分：蛋白胨10g；牛肉膏3g；氯化鈉5g；瓊脂10~20g；純水1000mL

   制法：將上述成分混合后，加熱溶解，調(diào)整pH為7.4~7.6，分裝于玻璃容器中，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，0~4℃冷藏保存。

3. 實(shí)驗(yàn)步驟

   生活飲用水：

   以無菌操作方法用無菌吸管或移液器吸取1mL充分混勻的水樣，注入無菌平皿中，傾注約15mL已融化并冷卻到45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻，每次檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)做一平行接種，同時(shí)另用一個(gè)平皿只傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基作為空白對照。

   待冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底面向上，置于36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，即為1mL水樣中的菌落總數(shù)。

    

   水源水：

   以無菌操作方法用無菌吸管或移液器吸取1mL充分混勻的水樣，注入盛有9mL無菌生理鹽水的試管中，混勻成1：10稀釋液；

   用無菌吸管或移液器吸取1：10的稀釋液1mL注入盛有9mL無菌生理鹽水的試管中，混勻成1：100稀釋液；

   按同法依次稀釋成1：1000、1：10000等稀釋度的液體備用。每稀釋一個(gè)稀釋度，應(yīng)更換一次1mL無菌吸管或吸頭。

   用無菌吸管或移液器吸取2個(gè)~3個(gè)適宜稀釋度的水樣1mL，分別注入無菌平皿內(nèi)。以下操作同生活飲用水的檢驗(yàn)步驟。

   
   

4. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

   結(jié)果報(bào)告：可用眼睛直接觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。

    

   同一稀釋度，若其中一個(gè)平皿有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的平均菌落數(shù)；若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半皿計(jì)數(shù)后×2以代表全皿菌落數(shù)。然后再求得該稀釋度的平均菌落數(shù)。

   不同稀釋度的選擇及報(bào)告方法，見下表。

   

   

    

四、測定方法——酶底物法

1. 原理：

   利用復(fù)合酶技術(shù),在培養(yǎng)基中加入多種獨(dú)特的酶底物,每一種酶底物都針對不同的細(xì)菌酶設(shè)計(jì),且包含最常見的介水傳播的細(xì)菌,所有的酶底物在被分解時(shí)均產(chǎn)生相同的信號(hào)。水樣檢測過程中,水樣中存在的細(xì)菌分解一種或者多種酶底物,之后產(chǎn)生一個(gè)相同的信號(hào),在檢測菌落總數(shù)時(shí),這個(gè)信號(hào)即為在波長366 nm紫外燈下所產(chǎn)生的熒光。使用基于復(fù)合酶底物技術(shù)(Multiple Enzyme Technology)的培養(yǎng)基,其中酶底物被微生物的酶水解﹐在36℃士1℃下培養(yǎng)48 h后能夠最大限度地釋放4-甲基傘形酮,4-甲基傘形酮在366 nm紫外燈照射下發(fā)出藍(lán)色熒光,對呈現(xiàn)藍(lán)色熒光的培養(yǎng)盤孔槽計(jì)數(shù)并查閱MPN表,可以確定原始水樣中最可能的菌落總數(shù)。

   本方法未稀釋水樣的檢測范圍為<738 MPN/mL。

    

2. 復(fù)合酶底物培養(yǎng)基

    

   成分：

   a) 葡萄糖                 1.25 g

   b）無水硫酸鎂              0.2 g

   c) 蛋白胨                 5.0 g

   d) 酵母提取物              3.5 g

   e) 4-甲基傘形酮磷酸酯         0.037 5 g

   f)4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷    0.03 g

   g)純水                 l 000 mL

    

   制法：將上述成分溶解于純水中,調(diào)整pH為6.7～7.3,經(jīng)0.22 um濾膜過濾除菌。制備好的培養(yǎng)基于2℃~8℃條件下保存?zhèn)溆谩?/span>

    

3. 實(shí)驗(yàn)步驟

   水樣稀釋：
   檢測所需水樣為l mL。若水樣污染嚴(yán)重,可對水樣進(jìn)行稀釋。以無菌操作方法用無菌吸管或移液器吸取1 mL充分混勻的水樣,注入盛有9 mL無菌生理鹽水的試管中,充分振蕩混勻后取1 mL進(jìn)行檢測,必要時(shí)可加大稀釋度,以10倍逐級(jí)稀釋。
   
   
   接種培養(yǎng)：
   向一無菌試管中加入9 ml制備好的液體培養(yǎng)基；如選用符合要求的成品培養(yǎng)基,則向裝有0.l g培養(yǎng)基的試管中加入9 mL無菌生理鹽水。取1 mL水樣加入上述試管中,渦旋振蕩混勻。
   將混勻后的水樣倒入培養(yǎng)盤中心位置,將培養(yǎng)盤蓋好,放置在水平桌面上﹐緊貼桌面順時(shí)針輕柔晃動(dòng)培養(yǎng)盤,將待測水樣分配到培養(yǎng)盤的所有孔槽中。
   將培養(yǎng)盤90°~120°豎起,使多余的水樣由盤內(nèi)海綿條吸收,將培養(yǎng)盤緩慢翻轉(zhuǎn)過來,倒置放于36 ℃士1℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48 h。可疊放培養(yǎng),不宜超過10層。

    

4. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

   結(jié)果計(jì)數(shù)
   將培養(yǎng)后的培養(yǎng)盤取出,倒置于暗處或紫外燈箱內(nèi),在6 W 366 nm紫外燈下約13 cm處觀察﹐記錄產(chǎn)生藍(lán)色熒光的孔數(shù)。如未放置在紫外燈箱內(nèi),觀察時(shí)需佩戴防紫外線的護(hù)目鏡。培養(yǎng)盤中的84個(gè)孔,無論熒光強(qiáng)弱,只要呈現(xiàn)藍(lán)色熒光即為陽性,但海綿條的熒光不計(jì)入結(jié)果。

    

   

   結(jié)果報(bào)告
   根據(jù)顯藍(lán)色熒光的孔數(shù),對照表⒉查出孔數(shù)對應(yīng)的每毫升樣品中的菌落總數(shù)的MPN值。如果樣品進(jìn)行了稀釋,讀取的結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)并報(bào)告之,結(jié)果以MPN/mL表示。如果所有孔均未顯熒光,則可報(bào)告為菌落總數(shù)未檢出。

    

   
   

   

   

    

   不同稀釋度的選擇及報(bào)告方法
   選擇菌落總數(shù)在<738 MPN/mL.范圍內(nèi)的稀釋度﹐如果只有一個(gè)稀釋度的結(jié)果符合此范圍,則將結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告結(jié)果。
   
   
   若有兩個(gè)或兩個(gè)以上稀釋度的結(jié)果均落在<738 MPN/mL,范圍內(nèi),則選擇稀釋度最小的結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告結(jié)果。
   
   
   若所有稀釋度的培養(yǎng)盤上均無藍(lán)色熒光,則以未檢出報(bào)告結(jié)果。