適用于食品中志賀氏菌的檢驗。

• 分液器

• 拍擊式均質器

• 定量接種環(huán)

• 厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)

• 生化鑒定系統(tǒng)

   

   

• 志賀氏菌增菌肉湯

• 麥康凱（MAC）瓊脂

• 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（XLD）瓊脂

• 三糖鐵（TSI）瓊脂

• 半固體瓊脂

• 營養(yǎng)瓊脂 

   

志賀氏菌檢驗流程

4.1 樣品制備、增菌

以無菌操作取檢樣 25 g（mL），加入裝有滅菌 225 mL 志賀氏菌增菌肉湯的均質杯，用旋轉刀片式均 質器以 8 000 r/min～10 000 r/min 均質；或加入裝有 225 mL 志賀氏菌增菌肉湯的均質袋中，用拍擊式均質 器連續(xù)均質 1 min～2 min，液體樣品振蕩混勻即可。于 41.5 ℃±１℃，厭氧培養(yǎng) 16 h～20 h。

4.2   分離

取增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板 上，于 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 20 h～24 h，觀察各個平板上生長的菌落形態(tài)。宋內氏志賀氏菌的單個菌落直徑大 于其他志賀氏菌。若出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續(xù)培養(yǎng)至 48 h 再進行觀察。志賀氏菌在 不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征見表 1。

注：若在指定培養(yǎng)時間內，出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察， 可繼續(xù)培養(yǎng)至48h再進行觀察。

4.3 初步生化試驗

1）分別在MAC瓊脂平板和XLD瓊脂平板上選取2個以上典型或可疑菌落；2）先用接種環(huán)挑取同一菌落，分別接種到TSI瓊脂斜面、半固體瓊脂和營養(yǎng)瓊脂斜面，再用接種針在TSI瓊脂斜面和半固體瓊脂斜面上進行穿刺；3）標記清楚后置于36±1℃培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)20～24h，觀察結果。

觀察TSI瓊脂中斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)硫化氫，且半固體瓊脂中無動力的菌株，挑取對應的營養(yǎng)瓊脂斜面上生長的菌苔，進行生化試驗和血清學分型。

4.4 生化試驗

用營養(yǎng)瓊脂斜面上生長的菌苔，進行生化試驗，包括β-半乳糖苷酶、尿素、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷的分解試驗。由于福氏志賀氏菌6型的生化特性和痢疾志賀氏菌或鮑氏志賀氏菌相似，必要時還需加做靛基質、甘露醇、棉子糖、甘油試驗，也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗，應為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化特性見表2。

4.5 附加生化實驗

由于某些不活潑的大腸埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes 堿性-異型） 菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集；因此前面生化實驗符合志賀 氏菌屬生化特性的培養(yǎng)物還需另加葡萄糖胺、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(36 ℃培養(yǎng) 24 h～48 h)。志 賀氏菌屬和不活潑大腸埃希氏菌、A-D 菌的生化特性區(qū)別見表 3。

由于傳統(tǒng)生化試驗過程需要使用大量試劑，且還需保證有足夠量的菌苔，因此有時可能需再次對可疑菌落進行擴繁。針對這些問題，目前常采用生化試劑盒或生化鑒定系統(tǒng)來完成這一步驟，以減少操作人員的工作量、降低工作難度，縮短檢測周期。

4.6 血清學鑒定（選做項目）

凡疑為志賀氏菌，可挑取營養(yǎng)瓊脂斜面上的培養(yǎng)物，做玻片凝集試驗。

1）抗原準備：志賀氏菌屬抗原結構由菌體抗原（O）及表面抗原（K）組成。一般采用1.2%～1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗用的抗原。

2）清凝集反：在玻片上選取2塊約1cmx2cm的區(qū)域，用接種環(huán)挑取一環(huán)待測菌分別放入選定區(qū)域內，往其中一塊下部加1滴抗血清，另一區(qū)域下部加1滴生理鹽水（對照），分別將菌落研成乳狀液，將玻片傾斜搖動，使菌與抗體/生理鹽水混合，1min后并對著黑色背景觀察結果。

抗血清中出現(xiàn)凝結成塊的顆粒，且生理鹽水中沒有發(fā)生自凝現(xiàn)象，那么凝集反應為陽性。

綜合以上生化試驗和血清學鑒定的結果，報告25g（mL）樣品中檢出或未檢出志賀氏菌。