1.樣品均質(zhì)和系列稀釋必須保證均勻

MPN法樣品均質(zhì)和稀釋液混勻非常重要。MPN法的兩點(diǎn)假設(shè)之一是“微生物在完全混勻的稀釋液里隨機(jī)分布”。混勻不充分，就滿足不了MPN法統(tǒng)計(jì)的基礎(chǔ)，從而不能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。

2.試管各稀釋度接種完全

通常，實(shí)驗(yàn)室按照3管接種系統(tǒng)來進(jìn)行MPN檢測(cè)，即每個(gè)稀釋度接種3管。然而，往往由于樣品中細(xì)菌數(shù)量比較低，陽性管數(shù)很少，很多檢測(cè)人員為圖省事僅接種前2個(gè)稀釋度。這種做法是十分錯(cuò)誤的，僅按照前兩個(gè)稀釋度的結(jié)果是沒法獲得MPN結(jié)果的。3個(gè)稀釋度中，低的稀釋度并不一定比高的稀釋度陽性管數(shù)多。不管前2個(gè)稀釋度的結(jié)果如何， 一個(gè)稀釋度的結(jié)果都是沒法預(yù)測(cè)的。因此，在實(shí)際工作中，即便預(yù)先估計(jì)樣品中細(xì)菌濃度很低， 9支試管也必須全部接種。

另外，要盡可能多接種幾個(gè)稀釋度，杜絕出現(xiàn)全部稀釋度都為陽性的情況，最好能保證結(jié)果中包含全陽性或全陰性的稀釋度。

3.對(duì)接種量和培養(yǎng)基量需要正確理解

接種量是MPN法成功與否的關(guān)鍵，一方面接種量要適當(dāng)以便于出現(xiàn)全陽性和全陰性的稀釋度，另一方面接種量必須準(zhǔn)確。MPN表和MPN計(jì)算公式都是和接種量密切相關(guān)的。而培養(yǎng)基的體積是多少并不重要，只要接種后培養(yǎng)基濃度接近正常濃度(單倍濃度)就可以了。通常接種稀釋液的體積是1 mL,這個(gè)體積必須準(zhǔn)確，而培養(yǎng)基的量是10 mL還是9mL都無所謂。常有人將MPN接種與平板計(jì)數(shù)稀釋混淆，以為必需1 mL稀釋液接種到9 mL培養(yǎng)基中。

4.確證后的試管才能計(jì)做陽性管

有的MPN法需要多步才能完成可疑菌的確證。只有最終確定為陽性的管才能計(jì)數(shù)為陽性管。如果沒有完成確證步驟，把中間步驟的陽性管計(jì)做陽性，就會(huì)獲得偏高的檢測(cè)結(jié)果。

5.正確理解MPN計(jì)數(shù)的檢測(cè)限和精密度

MPN表中最低結(jié)果通常表示為“<3/g( mL)"或“<30/100 g(mL)",因此很多檢測(cè)人員認(rèn)為MPN法的最高檢測(cè)限只能達(dá)到“3/g(mL)"或“30/ 100 g(mL)" 。

只要調(diào)整接種的樣品量， MPN法可以檢測(cè)任何濃度的樣品。例如， 3管法按等體積接種雙料肉湯，就能將固體樣品的檢測(cè)限提高到“0.3/g"。但是， MPN法是根據(jù)概率估計(jì)去推算結(jié)果，與平板計(jì)數(shù)直接計(jì)數(shù)法比起來結(jié)果的精密度要差一些。因此，實(shí)際工作中MPN法常用于污染水平低的樣品的檢測(cè)，污染水平低的樣品靠平板計(jì)數(shù)等直接計(jì)數(shù)方法是不易檢測(cè)的，尤其是對(duì)于固體樣品污染水平低于10 CFU/g時(shí)。

調(diào)整接種的樣品量還可以采取提高每個(gè)稀釋度的管數(shù)的方法，還能提高MPN法的精密度，獲得和平板計(jì)數(shù)相當(dāng)(每個(gè)稀釋度接種10管)甚至更高的精密度(每個(gè)稀釋度接種10管以上).由于增加每個(gè)稀釋度的管數(shù)導(dǎo)致工作量急劇增加，因此這種做法一般都采用單稀釋度接種系統(tǒng)，用來檢測(cè)低濃度的樣品。

6.陽性管數(shù)組合檢索不到的情況處理

有的檢測(cè)人員檢索MPN表時(shí)發(fā)現(xiàn)，有的陽性管數(shù)組合檢索不到，例如，"0-0-3",遇到這種情況不知該如何處理。

在以前的MPN法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)里， MPN表中包含所有的陽性管數(shù)組合(3管法包括4x4 x4=64組),甚至包括“0-0-3"這樣幾乎不可能出現(xiàn)的組合。事實(shí)上，我們應(yīng)該對(duì)這種結(jié)果持高度懷疑態(tài)度，應(yīng)棄用這種結(jié)果，重新檢測(cè)。因此，在新的MPN法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)里去掉了這些幾乎不可能出現(xiàn)的組合。例如， GB 4789.3-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》僅包括40組陽性管數(shù)組合。

7. MPN值需要正確理解

MPN值是基于統(tǒng)計(jì)的估計(jì)結(jié)果， MPN值是可能性最大的一個(gè)估計(jì)值，其95%置信區(qū)間有95%的可能包括真實(shí)結(jié)果。結(jié)果報(bào)告的MPN值要結(jié)合95%置信限來理解， MPN結(jié)果實(shí)際上是一個(gè)結(jié)果分布。

以下面一個(gè)例子來理解MPN結(jié)果。

【例4-3】 GB 4789.3-2016 中表B. 1接種量0. 1 g、0.01 g和0.001 g對(duì)應(yīng)的陽性管數(shù)2、 2、0。產(chǎn)品限值是“<20 MPN/g"。此產(chǎn)品合不合格?

查表得MPN值為“21 MPN/g",其上、下95%置信限分別為“42 MPN/g"和“4.5 MPN/g"。即每克樣品中21個(gè)大腸菌群，有95%的可能結(jié)果分布在每克4.5 (下限)個(gè)至42個(gè)(上限)之間。換句話說，接種量0.1g、0.01 g和 0.001 g對(duì)應(yīng)的陽性管數(shù)2、2、0的100次檢測(cè)中，有95個(gè)結(jié)果在每克4.5個(gè)至42個(gè)之間，其中每克21個(gè)的結(jié)果次數(shù)最多。

MPN結(jié)果是圖4-9中的曲線(以鐘形曲線表示),最可能的結(jié)果是"4.5"和“42"之間的可能性占95%。平板計(jì)數(shù)的結(jié)果“20"�？梢钥闯觯�由一半稍多的MPN結(jié)果是高于平板計(jì)數(shù)結(jié)果的，另外的MPN結(jié)果是低于平板計(jì)數(shù)結(jié)果的。因此，無法判斷MPN報(bào)告的結(jié)果是否高于平板計(jì)數(shù)的結(jié)果。

8.MPN計(jì)數(shù)結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果孰高孰低

與平板計(jì)數(shù)法相比，有人說MPN計(jì)數(shù)偏高，也有人說MPN計(jì)數(shù)偏低。其實(shí)兩者的高低并不是絕對(duì)的，而是與所用的培養(yǎng)基選擇性密切相關(guān)。當(dāng)MPN法的培養(yǎng)基選擇性差，更多的非目標(biāo)菌會(huì)被誤當(dāng)作陽性結(jié)果，計(jì)數(shù)容易偏高；當(dāng)MPN法的培養(yǎng)基選擇性高，低濃度的目標(biāo)菌生長不起來，計(jì)數(shù)就容易偏低。