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軍團菌是一種在自然界中很常見的細菌，可以引起以發(fā)熱和肺炎。是潛伏在我們身邊的“殺手”，它的部分癥狀和新冠肺炎較相似，且易發(fā)展為重癥，病死率為5%～30%。軍團菌侵入人體后，進攻兇猛，7天內(nèi)就可導致患者死亡，患者死亡大都因為呼吸衰竭，其次為休克和急性腎功能衰竭等。
軍團菌病主要的感染途徑是人吸入被污染的氣溶膠。
氣溶膠來源包括空調(diào)冷卻塔、冷熱水系統(tǒng)、加濕器、溫泉等。感染可通過吸入受污染的氣溶膠而發(fā)生，特別是易感的住院病人。大多數(shù)健康人群感染軍團菌后，表現(xiàn)為無癥狀或癥狀很輕的一過性感染，50歲以上人群、吸煙者、以及有慢性肺部疾病、免疫功能低下、腫瘤、基礎(chǔ)疾病等人群感染后發(fā)病風險較高。軍團菌病潛伏期一般為2-10天。一旦患病，病情常較嚴重。如治療延遲或治療不當，其病死率可高達15%-20%。軍團菌病患者可采用紅霉素、阿奇霉素等抗生素進行治療。
目前空調(diào)冷卻水、噴泉水等非飲用水中軍團菌污染問題已引起各國研究者的廣泛關(guān)注，而飲用水中軍團菌污染的相關(guān)研究較少。但近年來飲用水系統(tǒng)被軍團菌污染事件時有發(fā)生，特別是2020年受新冠疫情的影響，多數(shù)建筑長期封閉導致供水系統(tǒng)長時間水流停滯，為軍團菌的生長繁殖提供有利條件。
我國原衛(wèi)生部于2006年頒布了《公共場所集中空調(diào)通風系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范》的行業(yè)標準，依據(jù)該標準，各級疾控部門和監(jiān)督部門相繼開展了公共場所集中空調(diào)嗜肺軍團菌的監(jiān)測、評價和調(diào)查工作。2013年，中華人民共和國國家標準《公共場所衛(wèi)生檢驗方法》(GB/T 18204.5—2013)出臺，其中，第5部分介紹了集中空調(diào)冷凝水、冷卻水中嗜肺軍團菌的檢測方法。上述行業(yè)標準與國家標準對集中空調(diào)冷凝水、冷卻水中嗜肺軍團菌的檢測方法基本相同，且與歐美等國家監(jiān)測方法相似，即通過對集中空調(diào)冷凝水、冷卻水進行過濾、洗脫、酸處理、熱處理后進行細菌培養(yǎng)。分離培養(yǎng)法是目前國際通用檢測軍團菌的“金標準”，適用于各種環(huán)境水體。
近些年出現(xiàn)了多種新的嗜肺軍團菌定量檢測方法。其中，酶底物法作為一種同時適用于飲用水和非飲用水的嗜肺軍團菌檢測方法備受關(guān)注。酶底物法作為嗜肺軍團菌定量檢測方法，是嗜肺軍團菌利用酶底物試劑中氨基酸、維生素和其他營養(yǎng)物質(zhì)迅速生長和增殖，其代謝產(chǎn)物與試劑發(fā)生反應使溶液顯褐色，基于最可能數(shù)(most probable number，MPN)方法對樣本中嗜肺軍團菌進行定量分析。
今天我們先學習一下國家標準《公共場所衛(wèi)生檢驗方法》(GB/T 18204.5—2013)中空調(diào)冷卻水、冷凝水中嗜肺軍團菌檢測方法：
一
原理
樣品經(jīng)培養(yǎng)在 GVPC 瓊脂平板上生成典型菌落，并在 BCYE 瓊脂平板上生長而在 BCYE-CYE 瓊脂平板不生長，進一步經(jīng)生化實驗和血清學實驗鑒定確認的菌落為嗜肺軍團菌。
二
儀器設(shè)備
2.1.平皿：90mm。
2.2.CO2 培養(yǎng)箱：35℃ ~37℃
2.3.紫外燈:波長360nm士2nn.
2.4.濾膜過濾器
2.5.濾膜：孔徑 0.22μm~0.45μm。
2.6.真空泵
2.7.離心機
2.8.渦旋振蕩器
2.9.普通光學顯微鏡、熒光顯微鏡
2.10.水浴箱
2.11.廣口采樣瓶：玻璃或聚乙烯材料，磨口，容積 500 mL。
三
試劑和培養(yǎng)基
3.1.GVPC瓊脂平板
3.2.BCYE瓊脂平板
3.3.BCYE-CYE瓊脂平板
3.4.革蘭氏染色液
3.5.馬尿酸鹽生化反應管
3.6.軍團菌分型血清試劑
3.7.硫代硫酸鈉標準溶液[c(Na2S203)-- 0.1 mol/L]
四
采樣
4.1將采樣廣口瓶(2.11) 用前滅菌。
4.2每瓶中加人Na2S2O3(c =0.l mol/L)0.3 mL~0.5 mL,中和樣品中的氧化物。
4.3水樣采集位置：冷卻水采樣點設(shè)置在距塔壁20cm、液面下10cm 處，冷凝水采樣點設(shè)置在排水管或冷凝水盤處。
4.4 每個采樣點依無菌操作取水樣約 500 mL。
4.5 采集的樣品 2d 內(nèi)送達實驗室，不必冷凍，但要避光和防止受熱，室溫下貯存不應超過 15d。
五
檢驗步驟
5.1樣品的沉淀或離心:如有雜質(zhì)可靜置沉淀或1000 r/min離心lmin去除。
5.2樣品的過濾:將經(jīng)沉淀或離心的樣品通過濾膜(2.5)過濾,取下濾膜置于15mL滅菌水中,充分洗脫﹐備用。
5.3樣品的熱處理:取1 mL洗脫樣品﹐置50℃水浴(2.10)加熱30min。
5.4樣品的酸處理:取5 mL洗脫樣品,調(diào)pH至2.2,輕輕搖勻,放置5 min。
5.5樣品的接種:取洗脫樣品(5.2),熱處理樣品(5.3)及酸處理樣品(5.4)各0.l mL,分別接種GVPC平板。
5.6樣品的培養(yǎng):將接種平板靜置于CO2培養(yǎng)箱(2.2)中,溫度為35℃~37℃,CO2濃度為2.5%。無CO2培養(yǎng)箱可采用燭缸培養(yǎng)法。觀察到有培養(yǎng)物生成時,反轉(zhuǎn)平板,孵育10d,注意保濕。
5.7菌落觀察:軍團菌生長緩慢,易被其他菌掩蓋﹐從孵育第3d開始每天在顯微鏡(2.9)上觀察。軍團菌的菌落顏色多樣,通常呈白色、灰色、藍色或紫色﹐也能顯深褐色、灰綠色、深紅色;菌落整齊,表面光滑﹐呈典型毛玻璃狀,在紫外燈下,部分菌落有熒光。
5.8菌落驗證:從平皿上挑取個可疑菌落﹐接種BCYE瓊脂平板和BCYE-CYE瓊脂平板,35 ℃~37℃培養(yǎng)2 d,凡在BCYE瓊脂平板上生長而在BCYE-CYE瓊脂平板上不生長的則為軍團菌菌落。
5.9菌型確定:應進行生化培養(yǎng)與血清學實驗確定嗜肺軍團菌。生化培養(yǎng):氧化酶(一/弱＋),硝酸鹽還原(一),尿素酶(一),明膠液化(＋),水解馬尿酸。血清學實驗:用嗜肺軍團菌診斷血清進行分型。
