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一、培養(yǎng)基的制備
正確制備培養(yǎng)基時(shí)微生物檢驗(yàn)的最基礎(chǔ)步驟之一。使用脫水培養(yǎng)基和其他成分，尤其是含有有毒物質(zhì)(如膽鹽或其他選擇劑)的成分時(shí),應(yīng)遵守良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范和生產(chǎn)廠商提供的使用說(shuō)明。培養(yǎng)基的不正確制備會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基出現(xiàn)質(zhì)量問(wèn)題。
使用商品化脫水合成培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照廠商提供的使用說(shuō)明配置。記錄所有相關(guān)數(shù)據(jù)，如質(zhì)量/體積、pH、制備日期、滅菌條件和制備人員等。
使用各別成分制備培養(yǎng)基時(shí),應(yīng)按照配方準(zhǔn)確配制,記錄所有細(xì)節(jié)信息,如;培養(yǎng)基名稱和類型及試劑級(jí)別、每個(gè)成分物質(zhì)含量、制造商、批號(hào)、pH、培養(yǎng)基體積(分裝體積)、無(wú)菌措施(包括實(shí)施的方式、溫度及時(shí)間)、配置日期、人員等,以便潮源。
1.水
除特定要求,實(shí)驗(yàn)室用水的電導(dǎo)率在25℃下應(yīng)不高于25uS/cm(相當(dāng)于電阻率≥0.4MΩcm)。
微生物污染應(yīng)不超過(guò)103CFU/mL，最好低于102CFU/mL。應(yīng)根GB/T 5750.12或其他有效方法,定期檢驗(yàn)微生物的污染。
2.稱量和復(fù)水
稱量所需量的脫水培養(yǎng)基(注意防止吸入粉末，尤其是含有有害物質(zhì)的培養(yǎng)基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培養(yǎng)基結(jié)塊)后再加水至所需的量。
3.溶解和分裝
脫水培養(yǎng)基加水后適當(dāng)加熱,并不攪拌使其快速溶解，必要時(shí)，重新溶解。含瓊脂的培養(yǎng)基在加熱溶解前應(yīng)浸泡幾分鐘。
4.pH的測(cè)定和調(diào)整
用pH計(jì)測(cè)定pH,必要時(shí)在滅菌前調(diào)節(jié)pH，除特殊說(shuō)明外,培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25℃時(shí),要求pH的變化不超過(guò)0.2pH單位.通常使用濃度約為40g/L(約1mol/L)的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L（約1mol/L)的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH。如果滅菌后調(diào)節(jié)pH，溶液需滅菌。
注:商品化培養(yǎng)基在高壓滅菌前后pH可能發(fā)生明顯變化,但使用蒸餾水或去離子水時(shí),滅菌前無(wú)需調(diào)節(jié)pH。
5.分裝
將配置好的培養(yǎng)基分裝到適當(dāng)?shù)娜萜髦校萜鞯捏w積至少為體積的1.2倍。
6.滅菌
①概述
培養(yǎng)基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌或過(guò)濾滅菌。
有些培養(yǎng)基無(wú)需高壓滅菌,可煮滅菌。如，含亮綠的腸道菌培養(yǎng)基對(duì)光和熱特別敏感，應(yīng)在煮沸后快速冷卻，避光保存。同樣，一些試劑則不需要滅菌，直接使用(參見(jiàn)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或生產(chǎn)廠商的使用說(shuō)明）。
②濕熱滅菌
濕熱滅菌在高壓鍋或培養(yǎng)基制備器中進(jìn)行。高壓霉菌一般采用121℃±3℃霉菌15min。如果培養(yǎng)基的體積超過(guò)1000mL，要對(duì)滅菌條件進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。所有操作均要按照標(biāo)準(zhǔn)和使用說(shuō)明的規(guī)定進(jìn)行。
注：大容量培養(yǎng)基（＞1000mL）滅菌時(shí)可能會(huì)造成過(guò)度加熱。
加熱后應(yīng)采取適當(dāng)?shù)姆绞嚼鋮s，防止沸溢。這對(duì)大容量培養(yǎng)基和敏感性培養(yǎng)基（如含亮綠的培養(yǎng)基）是非常重要的。
③過(guò)濾滅菌
過(guò)濾滅菌可以在真空負(fù)壓或正壓條件下進(jìn)行。使用無(wú)菌設(shè)備和0.2um孔徑的濾膜。將過(guò)濾裝置的各個(gè)部分消毒滅菌,或使用預(yù)消毒設(shè)備。
一些濾膜上附著蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)(如抗生素)。為達(dá)到有效過(guò)濾,應(yīng)事先將濾膜用無(wú)菌水潤(rùn)濕。
④監(jiān)測(cè)
應(yīng)對(duì)經(jīng)濕熱或過(guò)濾滅菌的培養(yǎng)基進(jìn)行監(jiān)測(cè),尤其要對(duì)pH、色澤、滅菌效果和均勻度等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
7.添加劑的制備
制備含有有毒物質(zhì)(特別是抗生素）時(shí)應(yīng)小心操作，避免因粉末的擴(kuò)散造成實(shí)驗(yàn)人員過(guò)敏或發(fā)生其他不良反應(yīng)。采用適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施并小心按照產(chǎn)品使用說(shuō)明操作。不要使用過(guò)期的試劑；抗生素工作溶液現(xiàn)配現(xiàn)用；批量配置的抗生素溶液分裝后向冷凍保存，但解凍后的貯存溶液不可再次冷凍;廠商應(yīng)提供冷凍對(duì)抗生素活性影響的相關(guān)資料，也可由使用者自行測(cè)定。
二培養(yǎng)基配置中常見(jiàn)的問(wèn)題
1.培養(yǎng)基的pH什么時(shí)候測(cè)？用什么測(cè)？怎么測(cè)？
答：對(duì)于培養(yǎng)基應(yīng)該滅菌前測(cè)定和調(diào)整，滅菌后在測(cè)定，如果范圍超出正負(fù)0.2則培養(yǎng)基品質(zhì)不良。
2.滅菌后的培養(yǎng)基是否都要測(cè)pH值？如何測(cè)定pH值？
答：每個(gè)制備批次的培養(yǎng)基都應(yīng)測(cè)定pH，可采用pH試紙或pH計(jì)測(cè)量。
3.稀釋液滅菌后pH值是否有變化？有何影響？（如pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液）
答：一般pH有下降現(xiàn)象，約0.2左右，不同培養(yǎng)基pH變化可能不同。
4. 孟加拉培養(yǎng)基是否可以取代玫瑰紅鈉瓊脂進(jìn)行培養(yǎng)霉菌和酵母菌？
答：根據(jù)中國(guó)藥典，采用玫瑰紅鈉瓊脂。
5. 配制PH值7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液時(shí)有時(shí)因?yàn)楦邏簻缇鳒缇^(guò)程溫度過(guò)高而導(dǎo)致培養(yǎng)基混濁了，這種情況緩沖液還能用嗎？
答：建議按正常溫度滅菌，混濁培養(yǎng)基建議不要使用。
6.含瓊脂培養(yǎng)基在冷藏中形成冰晶怎么處理？銷毀還是加熱再用？
答：建議不要使用。
7.融化的培養(yǎng)基為什么不能再冷水中冷卻？
答：防止受熱不均引起結(jié)塊。
8.滅菌后，滅菌鍋需自然冷卻降壓才可以打開，這段時(shí)間是否會(huì)造成過(guò)度滅菌。
答：自然冷卻過(guò)程已經(jīng)計(jì)算在正常滅菌時(shí)間內(nèi)了，不會(huì)造成過(guò)度滅菌。
9.培養(yǎng)基所用器具若使用濕熱滅菌，是否必須待干燥后才可以使用？若烘干或其它方法，中間過(guò)程怎樣防止微生物污染？
答：如果是馬上使用且不是用于非水溶性供試液的制備及實(shí)驗(yàn)，不一定要烘干；否則，應(yīng)干燥后使用，滅菌及干燥盡量在同一鍋里進(jìn)行，或用紗布和牛皮紙包扎緊密。
10.培養(yǎng)基的避光儲(chǔ)存，是否配置好的培養(yǎng)基其全部放避光儲(chǔ)存？
答：最好都避光保存。無(wú)條件時(shí)，光敏感的培養(yǎng)基一定要。
11.商品培養(yǎng)基干粉說(shuō)是加蒸餾水溶解，實(shí)際操作是否可以用純化水或注射用水？
答：只要不含有任何可能抑制或影響微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)的水均可。
12.培養(yǎng)基及器具滅菌可否同一設(shè)備同滅菌時(shí)間進(jìn)行滅菌？
答：最好分開滅菌，條件不允許時(shí)可同爐滅菌，前提是都是潔凈無(wú)污染的。
13.培養(yǎng)基的保溫能否用60℃的培養(yǎng)箱，它與45℃—55℃水浴鍋保溫方法有何不同？
答：可以用恒溫培養(yǎng)箱保溫，但保溫溫度一般是50℃左右，且時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，一般是不超過(guò)4小時(shí)。
14.培養(yǎng)基的貯存是否需要放置于2—10℃冰箱內(nèi)？
答：需冷藏保存的培養(yǎng)基外包裝上會(huì)寫明。
15.培養(yǎng)基滅菌后成份會(huì)有所蒸發(fā)減少，如何處理這個(gè)問(wèn)題？
答：正常情況下蒸發(fā)量較少，可忽略不計(jì)。
16.培養(yǎng)基融化后出現(xiàn)渾濁是有哪些方面的原因引起的？應(yīng)如何避免？
答：可能的情況有
1.培養(yǎng)基配置用水不符合規(guī)定；
2.滅菌過(guò)程溫度升溫慢或降溫慢；
3.培養(yǎng)基儲(chǔ)存不當(dāng)；
4.融化時(shí)沸騰時(shí)間較長(zhǎng)等。
17.準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基有效期如何驗(yàn)證？
答：定期取出培養(yǎng)基驗(yàn)證其無(wú)菌性，促生長(zhǎng)能力等方面。
18.培養(yǎng)基配制好滅菌后，在高壓容器中保溫降至50℃左右，可不可行？
答：建議最好不要，避免過(guò)度受熱。
19.脫水培養(yǎng)基對(duì)濕度是否有要求？多少適宜？
答：按要求室溫干燥環(huán)境儲(chǔ)存即可。
20.培養(yǎng)基pH值測(cè)定溫度在25℃，這個(gè)溫度應(yīng)怎么控制？比如固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基使用過(guò)程中還能調(diào)節(jié)pH值嗎？
答：可水浴控制培養(yǎng)基溫度。
21.配制培養(yǎng)基過(guò)程中，按說(shuō)明書稱定量，加規(guī)定的純化水，煮沸溶解，為了避免煮沸過(guò)程總減少水分，是否要在配制過(guò)程適當(dāng)增加水?比如陪硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基。
答：可適量增加，自己掌握。
22.商品培養(yǎng)基一定要當(dāng)天配當(dāng)天用嗎？可否在一周內(nèi)用完？
答：不是即配即用的培養(yǎng)基的話，儲(chǔ)存得當(dāng)，可以使用。
23.稱量培養(yǎng)基時(shí)，注意不要吸入粉末，這粉末是指何物？
答：就是你所稱量的干粉培養(yǎng)基 ，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的粉末對(duì)呼吸道有刺激作用，而且培養(yǎng)基中的某些成分，如亞硒酸鹽、疊氮化鈉、乙酰胺等，長(zhǎng)期吸入并在體內(nèi)累積到一定量會(huì)對(duì)人體健康有危害。所以培養(yǎng)基配制稱量需做好個(gè)人防護(hù)，且最好選擇少粉塵環(huán)保型顆粒培養(yǎng)基。
24.煮培養(yǎng)基，用不銹鋼鍋在電磁爐上煮可行？硫乙醇培養(yǎng)基是否要煮沸？如何煮沸？用不銹鋼鍋在電磁爐上煮沸可行嗎？可不可以水浴煮沸呢？
答：硫乙醇應(yīng)煮沸，量大時(shí)，我實(shí)驗(yàn)室用不銹鋼鍋在電磁爐上煮沸。不建議水浴煮沸，因?yàn)樗≈蠓协傊酆茈y溶，導(dǎo)致瓊脂分裝不均勻，前段分裝的瓊脂含量少，后段分裝的瓊脂含量高，導(dǎo)致有的管或瓶中的凝固。
25.如培養(yǎng)基在高壓滅菌器中溫度需自然下降20度才開蓋嗎？
答：高溫滅菌器有安全閥，溫度下降到安全閥可打開時(shí)將培養(yǎng)基取出室溫冷卻，各型號(hào)滅菌器安全開蓋溫度不盡相同。
