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一、無菌操作要求
食品微生物實驗室工作人員，必須有嚴格的無菌觀念，許多試驗要求在無菌條件下進行，主要原因：一是防止試驗操作中人為污染樣品，二是保證工作人員安全，防止檢出的致病菌由于操作不當造成個人污染。
1. 接種細菌時必須穿工作服、戴工作帽。
2. 進行接種食品樣品時，必須穿專用的工作服、帽及拖鞋，應放在無菌室緩沖間，工作前經紫外線消毒后使用。
3. 接種食品樣品時，應在進無菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球將手擦干凈。
4. 進行接種所用的吸管，平皿及培養(yǎng)基等必須經消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼三次后使用。
5. 從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。
6. 接種樣品、轉種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒。
7. 接種環(huán)和針在接種細菌前應經火焰燒灼全部金屬絲，必要時還要燒到環(huán)和針與桿的連接處，接種結核菌和烈性菌的接種環(huán)應在沸水中煮沸5min，再經火焰燒灼。
8. 吸管吸取菌液或樣品時，應用相應的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。
二、無菌間使用要求
1. 無菌間通向外面的窗戶應為雙層玻璃，并要密封，不得隨意打開，并設有與無菌間大小相應的緩沖間及推拉門，另設有0.5-0.7m2的小窗，以備進入無菌間后傳遞物品。
2. 無菌間內應保持清潔，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作臺面，不得存放與實驗無關的物品。
3. 無菌間使用前后應將門關緊，打開紫外燈，如采用室內懸吊紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時間不少于30min，使用紫外燈，應注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。
4. 處理和接種食品標本時，進入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。
5. 在無菌間內如需要安裝空調時，則應有過濾裝置。
三、消毒滅菌要求
微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等，必須經滅菌后方能使用。
（一）干熱和濕熱高壓蒸氣鍋滅菌方法
1．滅菌前準備
①所有需要滅菌的物品首先應清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴密，如用金屬筒應將上面通氣孔打開。
②裝培養(yǎng)基的三角瓶塞，用紙包好，試管蓋好蓋，注射器須將管芯抽出，用紗布包好。
2．裝放
①干熱滅菌器：裝放物品不可過擠，且不能接觸箱的四壁。
②大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品分別包扎好，直接放入消毒筒內，物品之間不能過擠。
3．設備檢查
①檢查門的開關是否靈活，橡皮圈有無損壞，是否平整。
②壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位，關好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是否漏氣，壓力表與溫度計所標示的狀況是否吻合，管道有無堵塞。
③對有自動電子程序控制裝置的滅菌器，使用前應檢查規(guī)定的程序，是否符合于進行滅菌處理的要求。
4．滅菌處理
①干熱滅菌法：此法適應于在干熱情況下，不損壞、不變質、不蒸發(fā)的物品、較常用于玻璃器皿、金屬制品、陶瓷制品等的滅菌。
a. 器械器皿應清洗后再干烤，以防附著在表面的污物炭化。
b. 滅菌時安放物品不能過擠，不要直接接觸底和箱壁，物品之間留有空隙。
c.滅菌時將箱門關緊，接上電源，先將排氣孔打開約30min，排除滅菌器中的冷空氣，溫度升至160℃調節(jié)指示燈，維持1.5 –2h。
d.滅菌完畢后或溫度升溫過程中，須在60℃以下才能打開箱門。
②手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應按下列步驟進行：
a. 手提式高壓鍋在主體內加入3L清水，立式高壓鍋加水16L（重復使用時應將水量補足，水變混濁需更換）。
b. 手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用）。
c. 蓋好頂蓋擰緊，勿使漏氣；置滅菌器于火源上加熱，立式壓力鍋通上電源，并打開頂蓋上的排氣閥放了冷氣（水沸騰后排氣10-15min）。
d. 關閉排氣閥，使蒸氣壓上升到規(guī)定要求，并維持規(guī)定時間（按滅菌物品性質與有關情況而定）。
e. 達到規(guī)定時間后，對需干燥的物品，立即打開排氣閥排出蒸氣，待壓力恢復到零時，自然冷卻至60℃后開蓋取物，如為液體物品，不要打開排氣閥，而應立即將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復至零，溫度降到60℃以下再開蓋取物，以防突然減壓液體劇烈沸騰或容器爆破。
③臥式壓力鍋蒸氣滅菌器的使用按下列步驟進行：
a. 關緊鍋門，打開進氣閥，將蒸氣引入夾層進行預熱，夾層內冷空氣經阻氣器自動排出。
b. 夾層達到預定溫度后，打開鍋室進氣閥，將蒸氣引入鍋室，鍋室內冷空氣經鍋室阻氣器自動排出。
c. 待鍋室達到規(guī)定的壓力與溫度時，調節(jié)進氣閥，使保持恒定至規(guī)定時間。
d. 自然或人工降溫至60℃再開門取物，不得使用快速排出蒸氣法，以防突然降壓，液體劇烈沸騰或容器爆破。
e.使用自動程序控制式壓力蒸氣滅菌器，在放好物品關緊門后，應根據(jù)物品類別按動相應開關，以便按要求程序自動進行滅菌，滅菌時必須利用附設儀表記錄溫度與時間以備查，操作要求應嚴格按照廠家說明書進行。
5．滅菌溫度與時間
①干熱滅菌器滅菌溫度160℃，1.5-2h。
②壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時間見表34-1。
表34-1
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物品 |
滅菌時間，min |
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115℃ |
121℃ |
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含糖類等不耐熱培養(yǎng)基
染菌培養(yǎng)物
器械器皿 |
15-20
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30
30 |
（二）間歇滅菌方法
1．滅菌方法系利用不加壓力的蒸氣滅菌，某些物質經高壓蒸氣滅菌容易破壞，可用此法滅菌。
①將欲滅菌物品置于鍋內，蓋上頂蓋，打開排水口，使器內余水排盡。
②關閉排水口，打開進氣門，根據(jù)需要消毒10～20min。
③滅菌完畢關閉進氣門，取出物品待冷至室溫溫度，放入37℃溫箱過夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可達到滅菌目的。
2．血清凝固器使用方法，培養(yǎng)基中含有血清或雞蛋特殊成份時，因高熱會破壞其營養(yǎng)成份，故用低溫，可使血清凝固，又可達到滅菌目的。
①在使用該法滅菌的血清等分裝時，需嚴格遵守無菌操作，試管、平皿也經滅菌后使用。
②將培養(yǎng)基按要求使成斜面或高層，加足水后，接上電源，升溫75～90℃1h滅菌，放37℃溫箱過夜，再如此滅菌三次。
3. 煮沸消毒：可用煮鍋或煮沸消毒器，水沸騰后再煮5～15 min，也可在水中加入2﹪石炭酸煮沸5 min，加入0.02﹪甲醛,80℃煮60 min均可達到滅菌目的,但選用煮沸消毒的增消劑時,應注意對物品的腐蝕性。
4. 滅菌處理:滅菌后物品,按正常情況已屬無菌,從滅菌器中取出應仔細檢查放置,以免再度污染。
①物品取出,隨即檢查包裝的完整性,若有破壞或棉塞脫掉,不可作為無菌物品使用。
②取出的物品,如為包裝有明顯的水浸者,不可作為無菌物品使用。
③培養(yǎng)基或試劑等,應檢查是否符合達到滅菌后的色澤或狀態(tài),未達到者應廢棄.
④啟閉式容器,在取出時應將篩孔關閉。
⑤取出的物品掉落在地或誤放不潔這處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用。
⑥取出的合格滅菌物品,應存放于貯藏室或防塵柜內,嚴禁與未滅菌物品混放。
⑦凡屬合格物品,應標有滅菌日期及有效期限。
⑧每批滅菌處理完成后,記錄滅菌品名、數(shù)量、溫度、時間、操作者。
四、有毒有菌污物處理要求
微生物實驗所用實驗器材、培養(yǎng)物等未經消毒處理，一律不得帶出實驗室。
1. 經培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應放在嚴密的容器或鐵絲筐內，并隼中存放在指定地點，待統(tǒng)一進行高壓滅菌。
2. 經微生物污染的培養(yǎng)物，必須經121℃ 30 min高壓滅菌。
3. 染菌后的吸管，使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經121℃30 min高壓滅菌。
4. 涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，烈性菌的沖洗液必須沖在燒杯中，經高壓滅菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24 h后，煮沸洗滌。做凝隼試驗用的玻片或平皿，必須高壓滅菌后洗滌。
5. 打碎的培養(yǎng)物，立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。
污染的工作服或進行烈性試驗所穿的工作服、帽、口罩等，應放入專用消毒袋內，經高壓滅菌后方能洗滌。
五、培養(yǎng)基制備要求
培養(yǎng)基制備的質量將直接影響微生物生長。因為各種微生物對其營養(yǎng)要求不完全相同，培養(yǎng)目的的不同，各種培養(yǎng)基制備要求如下：
1. 根據(jù)培養(yǎng)基配方的成分按量稱取，然后溶于蒸餾水中，在使用前對應用的試劑藥品應進行質量檢驗。
2. PH測定及調節(jié)：PH測定要在培養(yǎng)基冷至室溫時進行，因在熱或冷的情況下，其PH有一定差異，當測定好時，按計算量加入堿或酸混勻后，應再測試一次。培養(yǎng)基PH值一定要準確，否則會影響微生物的生長或影響結果的觀察。但需注意因高壓滅菌可影響一些培養(yǎng)基的PH降低或升高，故不宜滅菌壓力過高或次數(shù)太多，以免影響培養(yǎng)基的質量，指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調完PH后再加入。
3. 培養(yǎng)基需保持澄清，便于觀察細菌的生長情況，培養(yǎng)基加熱煮沸后，可用脫脂棉花或絨布過濾，以除去沉淀物，必要時可用雞蛋白澄清處理，所用瓊脂條要預先洗凈涼干后使用，避免因瓊脂含雜質而影響透明度。
4. 盛裝培養(yǎng)基不宜用鐵、銅等容器，使用洗凈的中性硬質玻璃容器為好。
5. 培養(yǎng)基的滅菌既要達到完全滅菌目的，又要注意不因加熱而降低其營養(yǎng)價值，一般121℃ 15min即可，如為含有不耐高熱物質的培養(yǎng)基如糖類、血清、明膠等，則應采用低溫滅菌或間歇法滅菌，一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等，待基礎瓊脂高壓滅菌后涼至50℃左右再加入。
6. 每批培養(yǎng)基制備好后，應做無菌生長試驗及所檢菌株生長試驗。如果是生化培養(yǎng)基，使用標準菌株接種培養(yǎng)，觀察生化反應結果，應呈正常反應，培養(yǎng)基不應貯存過久，必要時可置4℃冰箱存放。
7. 目前各種干燥培養(yǎng)基較多，每批需用標準菌株進行生長試驗或生化反應觀察，各種培養(yǎng)基用相應菌株生長試驗良好后方可應用，新購進的或存放過久的干燥培養(yǎng)基，在配制時也應測PH，使用時需根據(jù)產品說明書用量和方法進行。
8. 每批制備的培養(yǎng)基所用化學試劑、滅菌情況及菌株生長試驗結果、制作人員等應做好記錄，以備查詢。
六、樣品采集及處理要求
1. 所采集的檢驗樣品一定要具有代表性，采樣時應首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等進行詳細調查，檢查是否有污染源存在。
2. 根據(jù)食品的種類及數(shù)量，采樣數(shù)量及方法應按標準檢驗方法的要求進行。
3. 采樣應注意無菌操作，容器必須滅菌，避免環(huán)境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新潔爾滅、酒精等消毒藥物滅菌，更不能含有此類消毒藥物或抗生素類藥物，以避免殺死樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可應用。
4. 樣品采集后應立即送往檢驗室進行檢驗，送檢過程中一般不超過3h，如路程較遠，可保存在1～5℃環(huán)境中，如需冷凍者，則在凍存狀態(tài)下送檢。
5. 檢驗室收到樣品后，進行登記（樣品名稱、送檢單位、數(shù)量、日期、編號等），觀察樣品的外觀，如果發(fā)現(xiàn)有下列情況之一者，可拒絕檢驗。
(1) 樣品經過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者，失去代表原食品檢驗意義者。
(2) 瓶、袋裝食品已啟開者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品形狀者（食物中毒樣品除外）。
(3) 按規(guī)定采樣數(shù)量不足者。
對送檢符合要求的樣品，檢驗室收到后，應立即進行檢驗，如果條件不具備，應置4℃冰箱存放，及時準備創(chuàng)造條件，然后進行檢驗。
6. 樣品檢驗時，根據(jù)其不同性狀，進行適當處理。
(1) 液體樣品接種時，應充分混合均勻，按量吸取進行接種。
(2) 固體樣品，用滅菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml滅菌生理鹽水或其他溶液中，用均質器攪碎混勻后，按量吸取接種。
(3) 瓶、袋裝食品應用滅菌操作啟開，根據(jù)性狀選擇上述方法處理后接種。
七、樣品檢驗、記錄和報告的要求
1. 檢驗室收到樣品后，首先進行外觀檢驗，及時按照國家標準檢驗方法進行檢驗，檢驗過程中要認真、負責、嚴格進行無菌操作，避免環(huán)境中微生物污染。
2.樣品檢驗過程中所用方法、出現(xiàn)的現(xiàn)象和結果等均要用文字寫出試驗紀錄，以作為對結果分析、判定的依據(jù)，記錄要求詳細、清楚、真實、客觀、不得涂改和偽造。
