本方法適合于中、長期菌種保藏,保藏時間一般為2-4年左右.

(1)用火焰滅菌的接種環(huán)取斜面菌種在平皿上劃線分離單菌落.

(2)平皿倒置于30℃或37℃恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24-48小時,至單菌落的大小為3mm左右.

(3)挑取一個單菌落,接種于一個裝50mL的300mL三角瓶中30℃或37℃振蕩培養(yǎng)10-15小時,至菌密度OD600為1.0-1.5.

(4)用火焰滅菌的接種環(huán)取少量種子液,涂片后,作革蘭氏染色,在顯微鏡下觀察菌體的形態(tài),及是否有雜菌.

(5)按30%甘油:種子液為1:1(V/V)的量加入無菌甘油, 混合后分裝至事先滅菌的菌種保存管(1-2mL/管),-70℃或液氮保存.

 

冷凍干燥保藏法

(1)準備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造,形狀可用長頸球形底的,亦稱淚滴型安瓿管,大小要求外徑6-7.5mm,長105mm,球部直徑9-11mm,壁厚0.6-1.2mm.也可用沒有球部的管狀安瓿管.塞好棉塞,1.05kg/cm2,121.3℃滅菌30分鐘,備用.

(2)準備菌種,用冷凍干燥法保藏的菌種,其保藏期可達數(shù)年至十數(shù)年,為了在許多年后不出差錯,故所用菌種要特別注意其純度,即不能有雜菌污染,然后在最適培養(yǎng)基中用最適溫度培養(yǎng),使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物.細菌和酵母的菌齡要求超過對數(shù)生長期,若用對數(shù)生長期的菌種進行保藏,其存活率反而降低.一般,細菌要求24—48小時的培養(yǎng)物;酵母需培養(yǎng)3天;形成孢子的微生物則宜保存孢子;放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7-10天.

(3)制備菌懸液與分裝以細菌斜面為例,用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中,制成濃菌液,每支安瓿管分裝0.2ml.

(4)冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售,價值昂貴,此處介紹的是簡易方法與裝置,可達到同樣的目的.

    將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍,無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰(固體CO2)酒精液或干冰丙酮液,溫度可達-70℃.將安瓿管插入冷凍劑,只需冷凍4-5分鐘,即可使懸液結冰.

(5)真空干燥為在真空干燥時使樣品保持凍結狀態(tài),需準備冷凍槽,槽內放碎冰塊與食鹽,混合均勻,可冷至-15℃.裝置儀器,安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶內.

    抽氣一般若在30分鐘內能達到93.3Pa(0.7mmHg)真空度時,則干燥物不致熔化,以后再繼續(xù)抽氣,幾小時內,肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥,一般抽到真空度26.7Pa(0.2mmHg),保持壓力6-8小時即可.

(6)封口抽真空干燥后,取出安瓿管,接在封口用的玻璃管上,可用L形五通管繼續(xù)抽氣,約10分鐘即可達到26.7Pa(0.2mmHg).于真空狀態(tài)下,以煤氣噴燈的細火焰在安瓿管頸中央進行封口.封口以后,保存于冰箱或室溫暗處.

    此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一,對一般生活力強的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用,即使對一些很難保存的致病菌,如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存.適用于菌種長期保存,一般可保存數(shù)年至十余年,但設備和操作都比較復雜.

 

濾紙保藏法

(1)將濾紙剪成0.5×1.2cm的小條,裝入0．6×8cm的安瓿管中,每管1-2張,塞以棉塞,1.05kg/cm2,121.3℃滅菌30分鐘.

(2)將需要保存的菌種,在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng),使充分生長.

(3)取滅菌脫脂牛乳1-2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內,取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內混勻,制成濃懸液.

(4)用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內,使其吸飽,再放回至安瓿管中,塞上棉塞.

(5)將安瓿管放入內有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中,用真空泵抽氣至干.

(6)將棉花塞入管內,用火焰熔封,保存于低溫下.

(7)需要使用菌種,復活培養(yǎng)時,可將安瓿管口在火焰上燒熱,滴一滴冷水在燒熱的部位,使玻璃破裂,再用鑷子敲掉口端的玻璃,待安瓿管開啟后,取出濾紙,放入液體培養(yǎng)基內,置溫箱中培養(yǎng).

    細菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏,前兩者可保藏2年左右,有些絲狀真菌甚至可保藏14-17年之久.此法較液氮、冷凍干燥法簡便,不需要特殊設備.

 

沙土保藏法

(1)取河沙加入10％稀鹽酸,加熱煮沸30分鐘,以去除其中的有機質.

(2)倒去酸水,用自來水沖洗至中性.

(3)烘干,用40目篩子過篩,以去掉粗顆粒,備用.

(4)另取非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅土,加自來水浸泡洗滌數(shù)次,直至中性.

(5)烘干,碾碎,通過100目篩子過篩,以去除粗顆粒.

(6)按一份黃土、三份沙的比例(或根據(jù)需要而用其他比例,甚至可全部用沙或全部用土)摻合均勻,裝入10×100mm的小試管或安瓿管中,每管裝1g左右,塞上棉塞,進行滅菌,烘干.

(7)抽樣進行無菌檢查,每10支沙土管抽一支,將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)48小時,若仍有雜菌,則需全部重新滅菌,再作無菌試驗,直至證明無菌,方可備用.

(8)選擇培養(yǎng)成熟的(一般指孢子層生長豐滿的,營養(yǎng)細胞用此法效果不好)優(yōu)良菌種,以無菌水洗下,制成孢子懸液.

(9)于每支沙土管中加入約0.5ml(一般以剛剛使沙土潤濕為宜)孢子懸液,以接種針拌勻.

(10)放入真空干燥器內,用真空泵抽干水分,抽干時間越短越好,務使在12小時內抽干.

(11)每10支抽取一支,用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒,接種于斜面培養(yǎng)基上,進行培養(yǎng),觀察生長情況和有無雜菌生長,如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長,則說明制作的沙土管有問題,尚須進一步抽樣檢查.

(12)若經(jīng)檢查沒有問題,用火焰熔封管口,放冰箱或室內干燥處保存.每半年檢查一次活力和雜菌情況.

(13)需要使用菌種,復活培養(yǎng)時,取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內,置溫箱中培養(yǎng).

    此法多用于能產生孢子的微生物如霉菌、放線菌,因此在抗生素工業(yè)生產中應用最廣,效果亦好,但應用于營養(yǎng)細胞效果不佳.

 

斜面低溫保藏法

    將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上,待菌充分生長后,棉塞部分用油紙包扎好,移至2-8℃的冰箱中保藏.

    保藏時間依微生物的種類而有不同,霉菌、放線菌及有芽孢的細菌保存2-4個月,移種一次.酵母菌兩個月,移種一次.細菌最好每月移種一次.

    此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法,優(yōu)點是操作簡單,使用方便,不需特殊設備,能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等.缺點是容易變異,因為培養(yǎng)基的物理、化學特性不是嚴格恒定的,屢次傳代會使微生物的代謝改變,而影響微生物的性狀;污染雜菌的機會亦較多.

 

液氮冷凍保藏法

(1)準備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管,要求能耐受溫度突然變化而不致破裂,因此,需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管,安瓿管的大小通常使用75×10mm的,或能容1.2mm液體的.

(2)加保護劑與滅菌保存細菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細胞時,則將空安瓿管塞上棉塞,1.05kg/cm2,121.3℃滅菌15分鐘:若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內預先加入保護劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液,加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限,而后再用1.05kg/cm2>,121.3℃滅菌15分鐘.

(3)接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液,裝入已滅菌的安瓿管;霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器,從平板內切取菌落圓塊,放入含有保護劑的安瓿管內,然后用火焰熔封.浸入水中檢查有無漏洞.

(4)凍結再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結至-30℃.若細胞急劇冷凍,則在細胞內會形成冰的結晶,因而降低存活率.

(5)保藏經(jīng)凍結至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內,然后再將小圓筒放入液氮保藏器內.液氮保藏器內的氣相為-150℃,液態(tài)氮內為-196℃.

(6)恢復培養(yǎng)保藏的菌種需要用時,將安瓿管取出,立即放入38-40℃的水浴中進行急劇解凍,直到全部融化為止.再打開安瓿管,將內容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng).

    此法除適宜于一般微生物的保藏外,對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏,而且性狀不變異.缺點是需要特殊設備.

 

液體石蠟保藏法

(1)將液體石蠟分裝于三角燒瓶內,塞上棉塞,并用牛皮紙包扎,1.05kg/cm2,121.3℃滅菌30分鐘,然后放在40℃溫箱中,使水汽蒸發(fā)掉,備用.

(2)將需要保藏的菌種,在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng),使得到健壯的菌體或孢子.

(3)用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟,注入已長好菌的斜面上,其用量以高出斜面頂端1cm為準,使菌種與空氣隔絕.

(4)將試管直立,置低溫或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長).

    此法實用而效果好.霉菌、放線菌、芽孢細菌可保藏2年以上不死,酵母菌可保藏1-2年,一般無芽孢細菌也可保藏1年左右,甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌,在37℃溫箱內,亦可保藏3個月之久.此法的優(yōu)點是制作簡單,不需特殊設備,且不需經(jīng)常移種.缺點是保存時必須直立放置,所占位置較大,同時也不便攜帶.從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后,接種環(huán)在火焰上燒灼時,培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺,應特別注意.