一、好氣微生物的分離

    分離的方法很多,大體可分為兩類：一類較為粗放,只能達(dá)到“菌落純”,如稀釋涂布法,劃線分離法,組織分離法等.前兩種方法由于操作簡便有效,工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較多.組織分離法則通常是從有病或特殊組織中分離菌株.另一類是較細(xì)的單細(xì)胞或單孢子分離方法,可達(dá)到“菌株純”或“細(xì)胞純”的水平.這類方法需采用專門的儀器設(shè)備,復(fù)雜的如顯微操作裝置,簡單的可利用培養(yǎng)皿或凹玻片作分離小室進(jìn)行分離.下面對這幾種分離純化方法分別加以介紹.

 

(一)稀釋涂布法

    把土壤樣品以十倍的級差,用無菌水進(jìn)行稀釋,取一定量的某一稀釋度的懸浮液,涂抹于分離培養(yǎng)基的平板上,經(jīng)過培養(yǎng),長出單個(gè)菌落,挑取需要的菌落移到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng).土壤樣品的稀釋程度,要看樣品中的含菌數(shù)多少,一般有機(jī)質(zhì)含量高的菜園土等,樣品中含菌量大,稀釋倍數(shù)高些,反之稀釋倍數(shù)低些.采用該方法,在平板培養(yǎng)基上得到單菌落的機(jī)會較大,特別適合于分離易蔓延的微生物.

 

(二)劃線分離法

    用接種環(huán)取部分樣品或菌體,在事先已準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基平板上劃線,當(dāng)單個(gè)菌落長出后,將菌落移入斜面培養(yǎng)基上,培養(yǎng)后備用.該分離方法操作簡便、快捷,效果較好.

    在樣品含菌量較少或某種目的微生物不多的情況下,微生物的純種分離方法可以簡化如下：第一種方法,取一支盛有3～5ml無菌水的粗試管或小三角瓶,取混勻的樣品少許(0.5g左右)放入其中,充分振蕩分散,用滅菌滴管取一滴土壤懸液于瓊脂平板上涂抹培養(yǎng),或者用接種環(huán)接一環(huán)于平板上劃線培養(yǎng).這種方法不需要菌落計(jì)數(shù),比以上常規(guī)稀釋法簡便.第二種方法,取風(fēng)干粉末狀的土樣少許(幾十毫克)直接灑在選擇性分離培養(yǎng)基平板上或混入培養(yǎng)基中制成平板,置適溫培養(yǎng)一定時(shí)間,長出菌落.例如分離小單孢菌就可采用該方法,從河泥中取樣,風(fēng)干研碎,取樣品粉末20～50mg直接加到天門冬酰胺培養(yǎng)基中,混合均勻制成平板,培養(yǎng)后長出魚卵狀菌落.這種方法有時(shí)分離不夠充分,可用劃線法進(jìn)一步純化.

 

(三)利用平皿的生化反應(yīng)進(jìn)行分離

    這是一種利用特殊的分離培養(yǎng)基對大量混雜微生物進(jìn)行初步分離的方法.分離培養(yǎng)基是根據(jù)目的微生物特殊的生理特性或利用某些代謝產(chǎn)物生化反應(yīng)來設(shè)計(jì)的.通過觀察微生物在選擇性培養(yǎng)基上生長狀況或生化反應(yīng)進(jìn)行分離,可顯著提高菌株分離純化的效率.

1. 透明圈法

    在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物,使培養(yǎng)基混濁.能分解底物的微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈,圈的大小初步反應(yīng)該菌株利用底物的能力.該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時(shí)采用較多,如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌都會在含有底物的選擇性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見的透明圈.在分離淀粉酶產(chǎn)生菌時(shí),培養(yǎng)基以淀粉為惟一碳源,待樣品涂布到平板上,經(jīng)過培養(yǎng)形成單個(gè)菌落后,再用碘液浸涂,根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)透明的水解圈來區(qū)別產(chǎn)酶菌株.如要分離該酸水解酶產(chǎn)生菌,可用雙層平板法,首先在普通平板培養(yǎng)基上把懸浮液涂抹培養(yǎng),等長出菌落后覆蓋一層營養(yǎng)瓊脂,內(nèi)含3%酵母RNA,0.7%瓊脂及 0.1mol/LEDTA,pH7.0,于42℃左右培養(yǎng)2～4h,四周產(chǎn)生透明圈的菌落,即為核酸分解酶產(chǎn)生菌.

    在分離某種產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株時(shí),也通常采用透明圈法進(jìn)行初篩.在選擇性培養(yǎng)基中加入碳酸鈣,使平板成混狀,將樣品懸浮液涂抹到平板上進(jìn)行培養(yǎng),由于產(chǎn)生菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解,形成清晰的透明圈,可以輕易地鑒別出來.分離乳酸產(chǎn)生菌時(shí),由于乳酸是一種較強(qiáng)的有機(jī)酸,因此,在培養(yǎng)基中加入的碳酸鈣不僅有鑒別作用,還有酸中和作用.

2. 變色圈法

    對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌,可在底物平板中加入指示劑或顯色劑,使所需微生物能被快速鑒別出來.如篩選果膠酶產(chǎn)生菌時(shí),用含0.2%果膠為惟一碳源的培養(yǎng)基平板,對含微生物樣品進(jìn)行分離,待菌落長成后,加入0.2%剛果紅溶液染色4h,具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現(xiàn)絳紅色水解圈.在分離谷氨酸產(chǎn)生菌時(shí),可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍(lán),它是一種酸堿指示劑,變色范圍在pH6.2～7.6,當(dāng)pH在6.2以下時(shí)為黃色,pH7.6以上為藍(lán)色.若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌,其菌落周圍會變成黃色,可以從這些產(chǎn)酸菌中篩選谷氨酸產(chǎn)生菌.

    在進(jìn)行解脂微生物的分離時(shí),雖然有很多精確的測定方法,如酸堿滴定法、電位滴定法、濁度滴定法、甘油滴定法及色譜分析法等,但由于步驟繁瑣,不適于大規(guī)模篩選測定.為提高分離篩選效率,多采用固體平板的變色圈法,如以吐溫為底物,尼羅藍(lán)(Nile blue)作為指示劑,根據(jù)變色圈大小來判斷脂肪酶活性的高低；也可用甘油三丁酸酯為底物,羅丹明B為指示劑,以熒光圈的大小來測定.最常使用的方法是把惡秦染料中的維多利亞藍(lán)和脂類底物混合,制成維多利亞藍(lán)乳脂瓊脂培養(yǎng)基平板,起始培養(yǎng)基調(diào)為中性,當(dāng)土壤樣品的懸濁液分離在平板上,具有脂解能力的菌落產(chǎn)生的脂肪酶水解油脂底物,使pH值由中性下降到微酸性或酸性,陽性解脂反應(yīng)能顯示粉紅到藍(lán)色的變化.如培養(yǎng)基起始pH為堿性,則陽性解脂反應(yīng)從咖啡色到藍(lán)綠色,能使脂類底物和解脂后的脂肪酸區(qū)別開來.后來又由Fryer等研究出一種改良的雙層法,先在平皿內(nèi)倒一層營養(yǎng)瓊脂,把一張棉紙圓片在被維多利亞藍(lán)染了色的乳脂中浸濕,鋪在已凝固的瓊脂表面,然后覆蓋一薄層含樣品的營養(yǎng)瓊脂,保溫培養(yǎng),解脂菌落就可以在棉紙中產(chǎn)生藍(lán)帶.

    分解解脂細(xì)菌的培養(yǎng)基(%)為：牛肉膏0.5、蛋白胨0.5、瓊脂2.0、大豆油5.0、維多利亞藍(lán)4mg.

    分離內(nèi)肽酶產(chǎn)生菌,除了用酪蛋白作底物平板產(chǎn)生透明圈進(jìn)行鑒別外,還可以用吲羥乙酸酯為底物加到分離培養(yǎng)基中,產(chǎn)生蛋白酶的菌落由于水解吲羥乙酸酯為3-羥基吲哚,后者能氧化生成藍(lán)色產(chǎn)物,根據(jù)呈色圈便可選出平板上產(chǎn)蛋白酶的菌落.培養(yǎng)基平板由兩層組成,底層含明膠1.2％,酵母汁0.1％,蛋白胨0.4％,瓊脂1.5％,待凝固后在其上覆蓋一層瓊脂,瓊脂含量為0.7％,由pH7.6的0.5mol/L的磷酸氫鉀緩沖液配制,配制濃度為0.083mol/L的吲羥乙酸酯溶液,取其中的0.3ml加入到上層瓊脂中倒平板.

通過平板上的變色圈還可以快速分離篩選產(chǎn)乙醇的菌株.在以糖為碳源的瓊脂平板的菌落上,覆蓋一層含有鹽類的瓊脂,該藍(lán)色物質(zhì)在醇脫氫酶和NAD作用下(在少量乙醇存在時(shí))反應(yīng)產(chǎn)生的電子脫色.因此生成乙醇的菌落便顯出一個(gè)淡白色的圈,暈圈的大小可初步表示乙醇的產(chǎn)量.

3. 生長圈法

    生長圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌.工具菌是一些相對應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株.將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營養(yǎng)物的平板上進(jìn)行培養(yǎng),若某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物,在該菌株的菌落周圍周圍便會形成一個(gè)混濁的生長圈.如嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌(如 E.coliP264)與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板,在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng),周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌.

    同樣,只要是篩選微生物所需營養(yǎng)物的產(chǎn)生菌時(shí),都可采用生長圈法,工具菌用 相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株,由于得到所需營養(yǎng),凡是目的微生物周圍便會出現(xiàn)混濁的生長圈.

4. 抑菌圈法

    常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選.通�？股�素的篩選要投入極大的人力、財(cái)力和時(shí)間.據(jù)估計(jì),篩選1萬個(gè)菌株才能得到1株有用的生產(chǎn)菌.因此設(shè)計(jì)一個(gè)準(zhǔn)確、迅速的篩選模型十分重要.抑菌圈法是常用的初篩方法,工具菌采用抗生素的敏感菌.若被檢菌能分泌某些抑制菌生長的物質(zhì),如抗生素等,便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈,很容易被鑒別出來.采用該方法已經(jīng)得到很多有用的抗生素,如春雷霉素和青霉素等.

     在青霉素菌種選育中,還可利用加入青霉素酶來篩選青霉素高產(chǎn)菌株,做法如下：將產(chǎn)黃青霉孢子進(jìn)行誘變處理,致死率約為99%.分離于瓊脂平板上,控制孢子濃度,使長成獨(dú)立菌落,一直培養(yǎng)到青霉素產(chǎn)量達(dá)到頂峰,加入0.106U/mol青霉素酶于鑒定菌枯草芽孢桿菌懸浮液中,鋪張于菌落平板表面,凝固后,培養(yǎng)17～20h.測量抑菌圈大小,根據(jù)有效指標(biāo)(抑菌圈直徑于菌落直徑之比)選出高產(chǎn)突變株.

    由于現(xiàn)有抗生素種類多樣,得到新的抗生素越來越困難.人們除了從一些特殊的 地方如極端環(huán)境中采樣分離抗生素的產(chǎn)生菌,也采用一些特殊的篩選方法,以期從普通土樣中分離篩選倒新的微生物及新的抗生素.除上述的抑菌圈外,稀釋法、擴(kuò)散法、生物自顯影法等也不同程度的得到應(yīng)用.在這些方法中,檢驗(yàn)菌的選擇十分重要,直接關(guān)系到檢出的靈敏度和篩選到的抗生素的活性和抗菌譜.如在篩選抗細(xì)菌抗生素時(shí),傳統(tǒng)上常用金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為檢驗(yàn)菌來檢驗(yàn)抗生素的抗性.采用聯(lián)合檢驗(yàn)菌,如枯草桿菌和綠色產(chǎn)色鏈霉菌活巴氏梭菌,可分離出抗菌活性低、對其他試驗(yàn)菌活性高的新抗生素,如黃色霉素族的抗生素,而這些抗生素在單獨(dú)使用枯草桿菌時(shí)無法檢出.

    海洋是新抗生素的重要來源.許多海洋生物體內(nèi)都含有微生物,這些微生物為宿主抵御病害起著關(guān)鍵作用.因此,從魚組織和蝦消化道里分離篩選抗癌藥物和抗炎癥藥物是一個(gè)有效地途徑.已從水母體內(nèi)篩到一種名為salinamide的抗生素,一種抗真菌抗生素istatin也從海洋生物體中分離出.

    在篩選抗霉菌抗生素時(shí),需根據(jù)其特點(diǎn)進(jìn)行篩選,因霉菌與哺乳動物細(xì)胞性質(zhì)相似,為減少藥物對人體的副作用,需挑選對霉菌有抗性但對人體安全的抗生素.由于哺乳動物不含幾丁質(zhì),因此可先篩選抑制幾丁質(zhì)合成酶的生理活性物質(zhì),再從中篩選所需抗生素.三國霉素和多氧菌素就是通過該方法篩選得到的.抗病毒抗生素及抗腫瘤藥物的篩選則可通過敏感細(xì)菌培養(yǎng)平板的噬菌斑來判斷.

    采用抑菌圈法,不僅能篩選抗生素,而且還能篩選某些酶類.

 

(四)組織分離法

    組織分離法是由一些有病組織或特殊組織中分離菌株的方法.如從患惡苗病的水稻組織中分離赤霉素,從根瘤中分離根瘤菌及從各種食用菌的子實(shí)體中分離孢子等.

1. 對一般有病組織的分離方法

    切除小塊含菌組織,用干凈水洗去組織表面污物.以10％漂白粉或0.1％升汞浸泡2～5分鐘進(jìn)行表面消毒,無菌水沖洗.將消毒后的組織移到平皿培養(yǎng)基上,置于適宜溫度(25～26℃)培養(yǎng)一定時(shí)間,即可在組織周圍四÷長出微生物.用肉眼或顯微鏡觀察菌落,基本確認(rèn)后挑入斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng).由這種方法挑選的菌株往往不純,必須在瓊脂平板上再分離純化,然后挑取單個(gè)菌落于斜面,進(jìn)一步篩選.

    從豆科植物的根瘤中分離根瘤菌：取新鮮健壯的根瘤,經(jīng)漂白粉或升汞溶液等進(jìn)行表面消毒后,用無菌鑷子將根瘤壓破,取出汁液少許與分離培養(yǎng)基混合倒入平皿中,攤平,培養(yǎng)后在平板上長出菌落,經(jīng)鏡檢觀察后確認(rèn)典型菌落,移入斜面.

2.食用菌孢子分離法

    食用菌的孢子分離法通常有兩種,即多孢子分離和單孢子分離.多孢子分離有混雜現(xiàn)象,不易篩選到優(yōu)良穩(wěn)定的菌株.因此,從育種角度最好采用單孢子分離.兩種方法的分離步驟、方法介紹如下：

(1)多孢子分離法

    取產(chǎn)量高、朵大、健壯無病并即將成熟的初生和單生子實(shí)體,用清水洗凈表面污物,對子實(shí)體外有膜保護(hù)著的菇類,如蘑菇、草菇,在0.1%～0.2%升汞溶液浸泡2～3 min,用無菌水沖洗數(shù)次.對子實(shí)體無膜外露的平菇等,不適于用升汞溶液浸泡,要用75%的酒精進(jìn)行表面消毒,再用無菌水沖洗.食用菌的孢子著生在子實(shí)體的腹面的菌褶上,成熟時(shí)會自動彈出來.孢子采集裝置：用一條兩端彎成鉤的鐵絲,一端鉤著一塊成熟的蠶豆大子實(shí)體,另一端掛在三角瓶的瓶口上.三角瓶內(nèi)事先制備好馬鈴薯—蔗糖培養(yǎng)基平板.懸掛的子實(shí)體距離培養(yǎng)基平板2～3cm.適溫培養(yǎng)1～2天,就有孢子陸續(xù)彈落于三角瓶底部的培養(yǎng)基上,經(jīng)過4～5天,孢子萌芽成菌絲,及時(shí)將菌絲尖端接入到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng),然后進(jìn)行生產(chǎn)性能對比試驗(yàn).

(2)單孢子分離法

    取一條鐵絲,彎曲成蚊香支架形狀,放在已消毒的玻璃板上.將消毒后的子實(shí)體懸掛在支架上方,下方置一個(gè)已滅菌的去蓋的培養(yǎng)皿,然后罩一個(gè)鐘罩,周圍縫隙用凡士林封好.將這套孢子收集器移到恒溫室內(nèi)培養(yǎng)1～2天,將有大量孢子彈到平皿上,收集孢子.以上操作全部在超凈臺或無菌室內(nèi)進(jìn)行.將收集到的孢子用稀釋法在馬鈴薯—蔗糖培養(yǎng)基平板上進(jìn)行單孢子分離,培養(yǎng)后把單孢子長出的菌落移接到斜面上,進(jìn)行生產(chǎn)性能比較試驗(yàn).

 

(五)單細(xì)胞或單孢子分離法

    采用特殊的儀器設(shè)備進(jìn)行單細(xì)胞或單孢子的分離.具體方法有多種,現(xiàn)主要介紹檸檬酸產(chǎn)生菌采用的小滴分離純化方法.操作如下：將待純化的孢子懸液稀釋約為1500ml-1,用校正口徑的滴管(每毫升400滴)吸取孢子并均勻滴于無菌干燥蓋玻片上,將其小心翻轉(zhuǎn)于凹玻片的孔穴上,穴內(nèi)加一滴已滅菌的培養(yǎng)液,蓋玻片和載玻片用凡士林密封.顯微鏡下觀察每個(gè)小滴,將只有一個(gè)孢子的小滴位置作好記錄,恒溫培養(yǎng),挑取單菌落于斜面.

除用凹玻片,還可用濾紙進(jìn)行單細(xì)胞或單孢子分離.具體作法如下：取與皿內(nèi)徑大小一致的濾紙3～4層,浸在培養(yǎng)液中,取出放在空皿內(nèi),在濾紙上滴幾滴甘油以防干燥,蓋好皿蓋,滅菌.將稀釋為1500ml-1的孢子懸液用上述滴管滴在濾紙上,每皿約點(diǎn)20點(diǎn)滴左右,經(jīng)恒溫培養(yǎng),每滴約出現(xiàn)10個(gè)菌落,將單菌落移接于斜面上.該方法能夠得到單細(xì)胞或單孢子,較為精確,但操作時(shí)要細(xì),否則不易得到理想結(jié)果.

 

(六)特殊菌類——環(huán)保降解菌的分離

    自然界存在著大量廢物及污染物,如多環(huán)芳烴(PAHs)、有機(jī)染料和顏料、表面活性劑、農(nóng)藥、酚類和鹵代烴等.在分離篩選這類物質(zhì)的降解微生物由于該物質(zhì)為唯一碳源或氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng).不能利用該物質(zhì)的微生物由于得不到營養(yǎng)被淘汰,能分解該物質(zhì)的微生物則正常生長.經(jīng)過幾個(gè)月的連續(xù)培養(yǎng)后,將富集培養(yǎng)液劃線或涂布于分離平板上,便能篩選到所需的環(huán)保降解菌株.分離平板可采用該污染物為底物的鑒別培養(yǎng)基,通過水解圈變色圈進(jìn)一步提高篩選效率.

    采用該方法分離苯胺、DDT、甲基對硫磷(MP)石油、甲胺磷等污染物都取得了良好的效果.如王倩如等人從經(jīng)甲胺磷農(nóng)藥廢水長期馴化的活性污泥中,篩選到能高效降解甲胺磷農(nóng)藥的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus crerus)和嗜中溫假單孢菌(Pseudomonas mesophilica),兩株混合菌對有機(jī)磷的去除率達(dá)99.7%.