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微生物的分離純化及稀釋平板菌落計(jì)數(shù)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2012-08-18  來(lái)源:生物在線
核心提示: 微生物的分離純化及稀釋平板菌落計(jì)數(shù)

一、實(shí)驗(yàn)原理
稀釋平板測(cè)數(shù)是根據(jù)微生物在高度稀釋條件下固體培養(yǎng)基上所形成的單個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成這一培養(yǎng)特征設(shè)計(jì)的計(jì)數(shù)方法,即一個(gè)菌落代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí),首先將待測(cè)樣品制成均勻的繁殖稀釋液,盡量使樣品中的微生物細(xì)胞分散開(kāi),使其成單個(gè)細(xì)胞存在,否則一個(gè)菌落就不只是代表一個(gè)細(xì)胞,再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中,使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。經(jīng)培養(yǎng)后,由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成菌落,統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,即可計(jì)算出樣品中的含菌數(shù)。此記數(shù)方法所計(jì)算的菌數(shù)是培養(yǎng)基上長(zhǎng)出來(lái)的菌落數(shù),故又稱活菌計(jì)數(shù)。一般用于某些產(chǎn)品檢定,如根瘤菌劑等產(chǎn)品檢定,生物制品檢驗(yàn),土壤含菌量測(cè)定及食品、水源的污染程度的檢驗(yàn)。
自然條件下,微生物常以群落狀態(tài)存在,這種群落往往是不同種類微生物的混合體。為了研究某種微生物的特性或者要大量培養(yǎng)和使用某種微生物,必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養(yǎng),這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。
在自然界中,土壤是微生物生活的良好環(huán)境,其中生活的微生物數(shù)量和種類都是極其豐富的,因此土壤是人類開(kāi)發(fā)利用微生物資源的重要基地。土壤中的微生物數(shù)量、種類與土壤肥力有關(guān),肥沃的土壤中多,貧瘠土壤中少。其生理類群則與土壤的其它理化性質(zhì),如通氣、pH有關(guān),例如在通氣良好的菜園土中,好氣性微生物占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)以菜園土為材料分離土壤中的好氣性細(xì)菌,并進(jìn)行數(shù)量測(cè)定。
分離微生物時(shí),一般是根據(jù)該微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)、pH、氧氣等要求的不同,供給它們適宜的生活條件,或加入某種抑制劑造成只利于該菌種生長(zhǎng),不利于其它菌種生長(zhǎng)的環(huán)境,從而淘汰不需要的菌種。分離微生物常用的方法有稀釋平板分離法和劃線分離法,根據(jù)不同的材料,可以采用不同方法,其最終目的是要在培養(yǎng)基上出現(xiàn)欲分離微生物的單個(gè)菌落,必要時(shí)再對(duì)單個(gè)菌落進(jìn)一步分離純化。在用稀釋平板分離微生物時(shí),還可以同時(shí)測(cè)定待分離的微生物的數(shù)量。
放線菌與細(xì)菌同屬原核微生物,是重要的抗生素產(chǎn)生菌,在土壤中的數(shù)量?jī)H次于細(xì)菌,尤其是在有機(jī)質(zhì)豐富、透氣性好的中性到微堿性土壤中的數(shù)量較多。本實(shí)驗(yàn)采用高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基分離和計(jì)數(shù)菜園土中的放線菌。
真菌在土壤中的數(shù)量次于細(xì)菌和放線菌,主要在有機(jī)質(zhì)豐富、透氣性好的偏酸性土壤中較多。分離土壤中的真菌并不難,但由于其菌落大,容易擴(kuò)展,計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性較低。本實(shí)驗(yàn)采用加有氯霉素或慶大霉素和孟加拉紅的馬丁氏培養(yǎng)基分離及計(jì)數(shù)菜園土中的真菌。按一般資料介紹為鏈霉素,但此種抗生素要先配成一定濃度的溶液,且應(yīng)于倒平板前才加入培養(yǎng)基中。在此培養(yǎng)基上,放線菌和細(xì)菌被氯霉素或慶大霉素和孟加拉紅所抑制,但大多數(shù)真菌能夠生存,且其菌落受孟加拉紅的抑制而較小,從而避免了某些真菌的擴(kuò)散蔓延而帶來(lái)的數(shù)量上的誤差。
二、實(shí)驗(yàn)材料
1、活材料:蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)菌劑。
2、培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基;高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基;加有氯霉素(或慶大霉素)和孟加拉紅的馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基:在1000mL培養(yǎng)基中加入注射用氯霉素2mL,孟加拉紅33.4mg,均于滅菌前加入。
3、材料:肥沃茶園土。
實(shí)驗(yàn)用品
內(nèi)裝15~20個(gè)玻璃珠的90mL無(wú)菌水、9mL無(wú)菌水、直徑9cm的無(wú)菌平皿、1mL無(wú)菌吸管、天平、稱樣瓶、記號(hào)筆、玻璃刮鏟、經(jīng)2mm土壤篩過(guò)篩的菜園、天平、試管架、無(wú)菌稱量紙、酒精燈、火柴、接種環(huán)、無(wú)菌水。
三、實(shí)驗(yàn)方法
(一)稀釋平板測(cè)數(shù)法
1、樣品稀釋液的制備
準(zhǔn)確稱取待測(cè)樣品10g,放入裝有90mL無(wú)菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中,用手或置搖床上振蕩20min,使微生物細(xì)胞分散,靜置20~30s,即成10-1稀釋液;再用1mL無(wú)菌吸管,吸取10-1稀釋液1mL,移入裝有9mL無(wú)菌水的試管中,吹吸3次,讓菌液混合均勻,即成10-2稀釋液;再換一支無(wú)菌吸管,吸取10-2稀釋液1mL,移入裝有9mL無(wú)菌水的試管中,也吹吸3次,即成10-3稀釋液;以此類推,連續(xù)稀釋,制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀釋菌液。
用稀釋平板計(jì)數(shù)時(shí),待測(cè)菌稀釋度的選擇應(yīng)根據(jù)樣品確定。樣品中所含待測(cè)菌的數(shù)量多時(shí),稀釋度應(yīng)高,反之則低。通常測(cè)定細(xì)菌菌劑含菌數(shù)時(shí),采用10-7、10-8、10-9稀釋度,測(cè)定土壤細(xì)菌數(shù)量時(shí),采用10-4、10-5、10-6稀釋度,測(cè)定放線菌數(shù)量時(shí),采用10-3、10-4、10-5稀釋度,測(cè)定真菌數(shù)量時(shí),采用10-2、10-3、10-4稀釋度。
2、平板接種培養(yǎng)
平板接種培養(yǎng)有混合平板培養(yǎng)法和涂抹平板培養(yǎng)法兩種方法。
⑴混合平板培養(yǎng)法
將無(wú)菌平板編上10-7、10-8、10-9號(hào)碼,每一號(hào)碼設(shè)置三個(gè)重復(fù),用無(wú)菌吸管按無(wú)菌操作要求吸取1×10-9稀釋液各1mL放入編號(hào)10-9的3個(gè)平板中,同法吸取10-8稀釋液各1mL放入編號(hào)1×10-8的3個(gè)平板中,再吸取1×10-7稀釋液各1mL放入編號(hào)1×10-7的3個(gè)平板中,由低濃度向高濃度時(shí),吸管可不必更換。然后在9個(gè)平板中分別倒入已熔化并冷卻至45~50℃的細(xì)菌培養(yǎng)基,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板,使菌液與培養(yǎng)基混合均勻,冷凝后倒置,在30℃下培養(yǎng)。至菌落長(zhǎng)出后即可計(jì)數(shù)。
⑵涂抹平板計(jì)數(shù)法
涂抹平板計(jì)數(shù)法與混合法基本相同,所不同的是先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無(wú)菌平板中,待凝固后編號(hào),然后用無(wú)菌吸管吸取0.1mL菌液對(duì)號(hào)接種在不同稀釋度編號(hào)的瓊脂平板上,每個(gè)編號(hào)設(shè)三個(gè)重復(fù)。再用無(wú)菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻,每個(gè)稀釋度用一個(gè)滅菌刮鏟,更換稀釋度時(shí)需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時(shí),也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上20~30min,使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi),然后將平板倒轉(zhuǎn),保溫培養(yǎng),至菌落長(zhǎng)出后即可計(jì)數(shù)。
(二)土壤中好氣性細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)
1、土壤稀釋液的制備
按“稀釋平板測(cè)數(shù)法”的相同步驟進(jìn)行,按無(wú)菌操作法將土壤稀釋至10-6即可。
2、分離方法
可以用三種方法進(jìn)行分離。
⑴混菌法:按“稀釋平板測(cè)數(shù)法”中的“混合平板培養(yǎng)法”進(jìn)行,使用的稀釋度為10-4、10-4、10-6三個(gè),各做3個(gè)重復(fù)。
⑵涂抹法:按“稀釋平板測(cè)數(shù)法”中的“涂抹平板測(cè)數(shù)法”進(jìn)行,使用的稀釋度為10-3、10-4、10-5三個(gè),各做3個(gè)重復(fù)。
以上兩法又統(tǒng)稱為稀釋平板分離法,可同時(shí)用于所分離菌的計(jì)數(shù)。
⑶劃線法:用滅菌接種環(huán)沾取10-1稀釋液1環(huán)于已凝固的平板上進(jìn)行劃線(圖示)。劃線可按以下兩種方式進(jìn)行,一種為交叉劃線法,是在平板的一邊做第一次“Z”字形劃線。轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿70°角,將接種環(huán)在火上燒過(guò)并冷卻后,通過(guò)第一次劃線部分,做第二次“Z”字形劃線。同法進(jìn)行第三次、第四次劃線。另一種為邊疆劃線法,是從平板邊緣的一點(diǎn)開(kāi)始,連續(xù)作緊密的波浪式劃線,直至平板中央。轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿180°,再?gòu)钠桨辶硪贿叄ú粺臃N環(huán))同樣劃線至平板中央。劃線法實(shí)質(zhì)上屬于一種“由點(diǎn)到線”的稀釋法,較適用于含菌比較單一的材料的純化,對(duì)于土壤這類微生物高度混雜的樣品則較少使用。
以上各種分離法,都應(yīng)按無(wú)菌操作進(jìn)行。所用的培養(yǎng)基若在倒平板前,按50μg/m L 的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放線菌酮(起抑制霉菌的作用),效果會(huì)更好。
3、培養(yǎng)
將上述接種過(guò)土壤懸液的平板倒置,于28~30℃培養(yǎng),至長(zhǎng)出菌落為止(24~36h)。
4、挑菌純化
在平板上選擇分離較好的有代表性的單菌落接種斜面,同時(shí)作涂片檢查,若發(fā)現(xiàn)不純,應(yīng)挑取此菌落做進(jìn)一步劃線分離,或制成菌懸液再做稀釋分離,直至獲得純培養(yǎng)體。
5、計(jì)數(shù)
選取混菌法和涂抹法中每皿菌落數(shù)30~300的平板,分別按“稀釋平板測(cè)數(shù)法”中的“混合平板測(cè)數(shù)法”和“涂抹平板測(cè)數(shù)法”中的公式計(jì)數(shù)。這樣求得的是每克原始土樣中的活菌數(shù),若要折算為每克干土的含菌數(shù),還應(yīng)將此數(shù)值除以干土在土樣中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(烘干土的質(zhì)量/原土樣的質(zhì)量)。
注:土壤含水量的測(cè)定是將一定質(zhì)量的土壤在105~110℃下烘干至恒重,再稱干重。
(三)、土壤中放線菌的分離與計(jì)數(shù)
1、土壤稀釋液的制備
按實(shí)驗(yàn)“稀釋平板計(jì)數(shù)法”中的方法進(jìn)行,將菜園土稀釋至10-5。在稀釋時(shí),可在盛無(wú)菌水的三角瓶中加10滴100g/L的石炭酸溶液和50μg/m L 的制霉菌素以抑制細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)。
2、分離方法
采用稀釋平板分離法,又可分為兩種方法。
⑴混菌法:按“稀釋平板計(jì)數(shù)法”中的“混合平板培養(yǎng)法”進(jìn)行,所不同者是稀釋度,應(yīng)采用10-3、10-4、10-5三個(gè)稀釋度,各做3個(gè)重復(fù)。
⑵涂抹法:按“稀釋平板計(jì)數(shù)法”中的“涂抹平板計(jì)數(shù)法”進(jìn)行,應(yīng)采用10-2、10-3、10-4三個(gè)稀釋度,各做3個(gè)重復(fù)。
3、培養(yǎng)
將上述接種過(guò)土壤懸液的平板倒置于28~30℃培養(yǎng)4~5d。
4、挑菌純化
從平板中選擇分離較好的放線菌菌落(應(yīng)與細(xì)菌菌落區(qū)別開(kāi))較接斜面,并制片作純度檢查,若不純,應(yīng)進(jìn)一步將該菌作稀釋平板分離或劃線分離,直至獲得純培養(yǎng)。
(四)、土壤中真菌的分離純化與計(jì)數(shù)
1、土壤稀釋液的制備
按實(shí)驗(yàn)“稀釋平板計(jì)數(shù)法”中的方法進(jìn)行,將土樣稀釋至10-4。
2、分離方法
采用稀釋平板分離法。又可分為兩種方法。
⑴混菌法:按“稀釋平板計(jì)數(shù)法”中的“混合平板培養(yǎng)法”進(jìn)行,所不同的是稀釋度,應(yīng)選10-2、10-3、10-4三個(gè)稀釋度進(jìn)行接種。
⑵涂抹法:按“稀釋平板計(jì)數(shù)法”中的“涂抹平板計(jì)數(shù)法”進(jìn)行,所不同的是稀釋度,應(yīng)選10-1、10-2、10-3三個(gè)稀釋度進(jìn)行接種。
3、培養(yǎng)
將上述接種土壤懸液的平板倒置于28℃培養(yǎng)3~5d。
4、挑菌純化
從長(zhǎng)有單菌落的平板中選取典型的真菌菌落(包括酵母菌菌落)轉(zhuǎn)接斜面,并同時(shí)制片作純度檢查。若不純,應(yīng)進(jìn)一步挑取該菌落采用劃線分離,或制成菌懸液進(jìn)一步作稀釋分離,直至獲得純培養(yǎng)體為止。
5、計(jì)數(shù)
選取每皿菌落數(shù)在10~100之間的平板用于計(jì)數(shù)。不應(yīng)遺漏酵母菌的菌落,必要時(shí)可制片檢查,以免誤為細(xì)菌菌落,具體方法見(jiàn)土壤中好氣性細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)。
6、菌種保存
將分離到的真菌轉(zhuǎn)接到PDA斜面上培養(yǎng),待長(zhǎng)好后,置于冰籍中保存,必要時(shí)進(jìn)行深入研究。
編輯:songjiajie2010

 
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