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微生物的分離是指將目標(biāo)菌種從微生物群體（尤其是不同微生物群體）中分離出來的技術(shù)，是微生物實(shí)驗(yàn)最基本的技術(shù)。微生物的分離培養(yǎng)方法主要有三種：劃線分離法，涂布平板法和傾注平板法。后兩種方法又可以同時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)，我們一起詳細(xì)學(xué)習(xí)一下微生物分離純化方法和技巧，微生物數(shù)量計(jì)數(shù)方法，一步步教你學(xué)習(xí)分離純化技術(shù)，爭取從實(shí)驗(yàn)室小白進(jìn)軍分離培養(yǎng)大師。 一、劃線分離法 1.定義： 利用接種環(huán)將目標(biāo)菌種在固體培養(yǎng)基表面劃線，菌種逐步稀釋，培養(yǎng)后能夠長出許多單一菌落，從而達(dá)到菌種分離純化的目的。 2.目的： 獲得純化的單菌落，越多越好。 3.操作步驟： (1)取菌種：取出目標(biāo)菌種，融化后，備用； (2)接種針滅菌：灼燒接種針進(jìn)行滅菌； (3)接種針冷卻：將接種針移至酒精燈旁邊冷卻； (4)蘸取菌種：甘油管用75%酒精消毒，待酒精揮發(fā)完全，在酒精燈火焰略微滅菌（防止烤糊），然后用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌種； (5)劃線：取已經(jīng)備好的固體平板，邊轉(zhuǎn)動(dòng)平板邊用酒精燈火焰滅菌，打開平板（靠口朝酒精燈），用上述接種環(huán)在平板上劃線，先在一側(cè)連續(xù)劃線3-4次，邊轉(zhuǎn)動(dòng)平板邊用酒精燈灼燒接種環(huán)，冷卻后，用接種環(huán)穿過第一次劃線部分繼續(xù)劃線3-4次，同樣方法進(jìn)行第三次劃線，或第四次劃線（根據(jù)菌液濃度和菌種類型確定劃線次數(shù)），灼燒接種環(huán)； (6)標(biāo)記：在平板底部邊緣處標(biāo)記菌種名稱，日期和其他信息； (7)培養(yǎng)：放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (8)保存：待培養(yǎng)完成后保存于4℃冰箱，待用。 4.操作技巧： (1)甘油管菌種取出后，盡量不要放回去，或者標(biāo)記清楚，反復(fù)凍融菌種效果不好。 (2)灼燒接種針時(shí)，一定要燒紅。 要燒紅！要燒紅！要燒紅！重要的事情說三遍，不燒紅滅菌不徹底，容易污染，也可能出不來單菌落。
(3)燒紅的接種針一定要冷卻后再使用，如何確定接種針是否冷卻？ 用接種針沿著固體培養(yǎng)基內(nèi)側(cè)邊緣或不可能用到的區(qū)域“輕點(diǎn)”，試一下固體培養(yǎng)基是否能夠融化，如果融化，說明溫度過高，繼續(xù)冷卻；如果不融化，說明接種針已經(jīng)冷卻，可以使用。 (4)甘油管菌種的濃度直接影響到劃線區(qū)域的分布，如何確定甘油管菌種濃度？ 第一種方法，事先查閱試驗(yàn)記錄，確定甘油管菌種濃度。 第二種方法，借助顯微鏡觀察，粗略判斷甘油管菌種濃度。 第三種方法，測量吸光度，推測甘油管菌種濃度。
(5)劃線過程，要求掃尾，掃尾出單菌落效果良好。 但是，在實(shí)際操作中，很少人掃尾，因?yàn)橛袝r(shí)候看不清尾部在哪，直接在附近區(qū)域劃線，效果也不錯(cuò)。 (6)一定要標(biāo)記清楚菌種信息和劃線日期，一般情況在培養(yǎng)皿底部邊緣處標(biāo)記。 5.注意事項(xiàng)：
(1)除樣品外，所有試驗(yàn)都必須在無菌環(huán)境下進(jìn)行，在打掃衛(wèi)生、實(shí)驗(yàn)室消毒過程中，一定要做好個(gè)人防護(hù)。 (2)試驗(yàn)過程中，一定要正確使用酒精燈，避免著火。 (3)一定要在酒精燈旁邊操作。 (4)試驗(yàn)結(jié)束一定要將無關(guān)物品從超凈工作臺(tái)中取出，該滅菌的物品一定要滅菌后再處理，避免交叉污染。 (5)試驗(yàn)過程中，盡量減少人員流動(dòng)。 (6)試驗(yàn)過程中，避免手部接觸平板邊緣，以免造成污染。 (7)試驗(yàn)過程中，如果出現(xiàn)意外，比如說著火，別著急，拿上濕抹布覆蓋即可。 1.定義： 待分離微生物樣品經(jīng)過一系列梯度（一般10倍遞增）稀釋后，使微生物菌體充分分散，成為單細(xì)胞，然后再取出一定量，涂布到固體培養(yǎng)基表面的方法，再經(jīng)過適宜的培養(yǎng)條件，形成單菌落的過程。 2.目的： (1)獲得純培養(yǎng)物-目標(biāo)菌。 (2)獲得純培養(yǎng)在微生物雜菌中的數(shù)量或比例—平板計(jì)數(shù)。
3.操作步驟： 梯度稀釋步驟：
(1)稱量：準(zhǔn)確稱取待測樣品1g或量取待測樣品1mL。 (2)稀釋：將上述樣品放入裝有99mL無菌生理鹽水（有小玻璃珠）的250mL三角瓶中，記錄。 (3)搖勻：將上述三角瓶放置于搖床上振蕩30min，使微生物細(xì)胞充分分散，靜置20-30s，即成10-2稀釋液。 (4)繼續(xù)稀釋：再用1mL無菌移液器，吸取上述稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液和水混合均勻，即成10-3稀釋液。 (5)繼續(xù)稀釋：再換一支無菌移液器，吸取10-3稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，即成10-4稀釋液。 (6)繼續(xù)稀釋：以此類推，連續(xù)梯度稀釋，制成10-7、10-8、10-9 等一系列稀釋菌液。 涂布平板步驟：
(1)標(biāo)記：將事先制備好的無菌平板上標(biāo)記10-7、10-8、10-9，每一個(gè)梯度稀釋設(shè)置三個(gè)重復(fù)。 (2)涂布：用無菌移液器分別吸取10-7稀釋液0.1mL放入編號(hào)10-7的3個(gè)平板中，然后用涂布棒或涂布器將菌液在平板上涂抹均勻，每個(gè)稀釋度用一個(gè)涂布器，用完涂布器酒精燈灼燒滅菌。 (3)繼續(xù)涂布：同樣涂布10-8稀釋液和10-9稀釋液，切記更換涂布棒。 (4)培養(yǎng)：將涂布好的平板平放于超凈臺(tái)上靜置10min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板放置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。 (5)計(jì)數(shù)：至長出菌落后即可計(jì)數(shù)。 (6)保存：將單菌落平板儲(chǔ)存至4℃保存。
(1)計(jì)數(shù)原則，平板上菌落數(shù)30-300個(gè)為合格。 (2)如果只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)，則以該稀釋度平均菌落數(shù)除以涂布平板所用稀釋液體積(0.1mL)，乘以稀釋倍數(shù)作為該樣品的細(xì)菌總數(shù)。 (3)如果有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合要求，則按照兩者菌落總數(shù)之比來決定，如果小于2，取兩者的平均值如果大于2，取較小的菌落總數(shù)。 4.操作技巧： (1)前幾個(gè)稀釋梯度，尤其是第一個(gè)梯度適當(dāng)放大稀釋倍數(shù)。 這樣不容易丟失目標(biāo)菌，也可以很好地對(duì)樣品進(jìn)行溶解。
(2)學(xué)會(huì)使用玻璃珠。 玻璃珠的作用是研磨，尤其是粉末或顆粒性樣品，可以將顆粒表面微生物與液體充分接觸。 (3)勤換槍頭或移液管。 這樣不容易造成不同稀釋度間混亂，防止不同梯度間取樣不準(zhǔn)。
(4)一定要搖勻。 平板涂布法的難點(diǎn)就在于稀釋，稀釋不準(zhǔn)確后面一切都化為零，一定要搖勻再取樣。
(5)利用顯微鏡粗略估測稀釋倍數(shù)。 并不是每一個(gè)樣品都需要稀釋到10-9，而是要根據(jù)樣品中微生物的數(shù)量進(jìn)行稀釋。 (6)涂布完成后，靜置10min再倒置培養(yǎng)。 靜置有利于微生物在培養(yǎng)基表面吸附，直接倒置培養(yǎng)，可能倒置菌液向一側(cè)流動(dòng)。
(7)倒固體培養(yǎng)基的時(shí)候，可以適當(dāng)吹干或提前一到兩天倒平板。 平板表面沒有多余水分且比較濕潤，涂布時(shí)候既容易涂開也不會(huì)造成出現(xiàn)菌苔。 5.注意事項(xiàng)： (1)注意涂布力度，大小適宜，不應(yīng)劃破培養(yǎng)基的表面。 (2)如果發(fā)現(xiàn)平板上水太多，處理后再使用。 (3)切記寫清楚標(biāo)記。 (4)試驗(yàn)完畢，注意灼燒涂布器，以免影響環(huán)境，造成交叉污染。 待分離微生物樣品經(jīng)過一系列梯度（一般10倍遞增）稀釋后，使微生物菌體充分分散，成為單細(xì)胞，然后再取出一定量稀釋液和固體培養(yǎng)基混勻，傾注到固體培養(yǎng)基的方法，再經(jīng)過適宜的培養(yǎng)條件，形成單菌落的過程。
獲得純培養(yǎng)在微生物雜菌中的數(shù)量或比例—平板計(jì)數(shù)。
梯度稀釋步驟：同平板涂布法。
(2)標(biāo)記：將事先制備好的無菌平板上標(biāo)記10-7、10-8、10-9，每一個(gè)梯度稀釋設(shè)置三個(gè)重復(fù)。
(3)傾注：將固體培養(yǎng)基冷卻至適合溫度后，用無菌移液器吸取10-7稀釋液0.1mL放入固體培養(yǎng)基中混勻，然后倒入編號(hào)10-7的3個(gè)培養(yǎng)皿中，或者用無菌移液器吸取10-7稀釋液0.1mL放入編號(hào)10-7的3個(gè)平板中，倒固體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)皿中混勻。 (4)繼續(xù)傾注：同樣傾注10-8稀釋液和10-9稀釋液。 (5)培養(yǎng)：將傾注好的平板平放于超凈臺(tái)上靜置，待凝固后，將平板放置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。
(2)培養(yǎng)基和稀釋液混勻過程中，沿壁搖勻，以免產(chǎn)生起泡，影響觀察和美觀。 沿壁搖勻，能夠保證培養(yǎng)基和稀釋液充分混合，也不會(huì)產(chǎn)生氣泡，切勿猛烈搖晃，氣泡太多，制成的平板無法計(jì)數(shù)。
(3)梯度稀釋過程，一般用試管，試管長度要適宜，不宜過長，不方便操作，也不宜過短，無法搖勻或容易溢出。
(4)為了操作方便，可以采用離心管代替試管進(jìn)行梯度稀釋，上下顛倒，容易混勻。 (5)實(shí)驗(yàn)過程中用到的無菌水是無菌生理鹽水，保護(hù)細(xì)胞。
(1)整個(gè)過程，需要在無菌環(huán)境下進(jìn)行。 (2)固體培養(yǎng)基放置在水浴鍋中，也要經(jīng)常搖動(dòng)，不能靜置。 (3)如果發(fā)現(xiàn)平板上水太多，處理后再使用。 (4)切記寫清楚標(biāo)記。 (5)試驗(yàn)完畢，注意灼燒涂布器，以免影響環(huán)境，造成交叉污染。
平板涂布法是將不同梯度的稀釋液分別取少量，加入不同的固體培養(yǎng)基上，然后用涂布棒在平板表面涂布均勻。
二、涂布平板法
計(jì)數(shù)原則：
三、傾注平板法
1.定義：
2.目的：
3.操作步驟：
梯度稀釋步驟：同平板涂布法。
傾注平板步驟：
(1)制備培養(yǎng)基：準(zhǔn)備固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿，高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后固體培養(yǎng)基放置于水浴鍋中備用。
(6)計(jì)數(shù)：待長出單菌落后即可計(jì)數(shù)。
菌落計(jì)數(shù)：同平板稀釋法。
4.操作技巧：
(1)固體培養(yǎng)基溫度不宜過高，過高會(huì)燙死微生物；溫度也不能太低，容易凝固結(jié)塊，無法和稀釋液混勻。如何確定合適的溫度？
用手心手背觸摸培養(yǎng)基，手心不燙手背燙的溫度，基本就是50℃左右（不同人溫度敏感性有一定差異）。
根據(jù)不同目標(biāo)菌種，確定合適的溫度，但一定要考慮固體培養(yǎng)基凝固的溫度，一般40℃左右凝固。
5.注意事項(xiàng)：
四、平板涂布法和傾注平板法的區(qū)別和聯(lián)系
1.第一步都是先梯度稀釋樣品，稀釋好后，分離方式不同。
傾注平板法是將不同梯度的稀釋液分別取少量，和融化好的培養(yǎng)基混勻后倒入培養(yǎng)皿中。
2.固體培養(yǎng)基的處理方式不同
平板涂布法是將固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿滅菌后，培養(yǎng)基冷卻至合適溫度再倒平板，平板凝固后才可以使用，要么無法涂布。
傾注平板法是將固體培養(yǎng)基滅好后，放置在恒溫水浴鍋中，一直等到備好不同梯度稀釋液后，固體培養(yǎng)基冷卻至適合溫度跟不同梯度稀釋液混勻，然后倒入干凈的培養(yǎng)皿中。
傾注平板法為了涂布均勻平整，有時(shí)候需要事先倒一點(diǎn)固體培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿中，就是雙層平板。
3.平板涂布法優(yōu)勢和劣勢
(1)涂布技術(shù)不好，經(jīng)常涂布不勻，無法計(jì)數(shù)。
(2)不需要控制固體培養(yǎng)基溫度。
(3)可以將所有單菌落挑出來，保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。
4.傾注平板法優(yōu)勢和劣勢
(1)不需要涂布，省去了涂布不勻的麻煩。
(2)需要控制固體培養(yǎng)基溫度。
(3)無法將所有單菌落挑出來。
